[发明专利]以单磷酸腺苷和腺苷脱氨酶为激发物的电致发光逻辑门

说明书

技术领域

本发明涉及DNA逻辑门的构建，具体地说是以单磷酸腺苷和腺苷脱氨酶为激发物的电致发光逻辑门。

背景技术

核酶和核酸适体是现在受到广泛关注的核酸结构，它们可为DNA，也可以为RNA，或者DNA和RNA的杂合体。目前核酸以及核酶都已经被广泛应用到DNA逻辑门的研制中，而核酸适体的应用还未见报道。目前的DNA逻辑门或计算机的输入输出信号主要是通过分子生物学操作或荧光阅读器来实现的。显然如果能够通过电信号来进行通讯就有可能显著提高传输效率。将修饰了电化学发光分子和猝灭基团的生物大分子、细胞等物质的核酸适体固定在电极上，当加入生物大分子、细胞时，适体结构发生变化，使发光基团与猝灭基团的位置发生变化，从而使逻辑门的输出信号发生变化。由于单链随机寡核苷酸片段易形成发卡、口袋、假节、G2四聚体等二级结构，能与蛋白质、核酸、小肽、氨基酸、有机物，甚至金属离子结合，形成具有特异性识别作用的复合物。利用这一原理，蛋白质、核酸、小肽、氨基酸、有机物、细胞等均可作为DNA逻辑门的输入，从而达到对这些物质的检测。在玻碳电极上固定多壁碳纳米管可以增加玻碳电极的比表面积，比起直接在玻碳电极上修饰ssDNA，多壁碳纳米管修饰电极可以缠绕更多的ssDNA，如果在ssDNA修饰电致发光物质，则可以大大加强电极的灵敏度。本发明基于核酸适体的多样性和复杂性，用于DNA逻辑门的构建。将修饰了电化学发光分子和猝灭基团的单链DNA与核酸适体杂交，当加入单磷酸腺苷时，适体结构发生变化，使发光基团与猝灭基团的位置发生变化，从而使逻辑门的输出信号发生变化。

发明内容

本发明研究了以单磷酸腺苷和腺苷脱氨酶为激发物的电致发光逻辑门，由于适体具有多样性和复杂性，并且能与其配体发生特异性结合，所以可以用于逻辑门的构建。将修饰了电化学发光分子和猝灭基团的生物大分子、细胞等物质的核酸适体固定在电极上，当加入生物大分子、细胞时，适体结构发生变化，使发光基团与猝灭基团的位置发生变化，从而使逻辑门的输出信号发生变化。本发明设计的逻辑门操作是建立在单磷酸腺苷与其适体的特异性结合以及腺苷脱氨酶对单磷酸腺苷脱氨基作用的基础上的。利用含有单磷酸腺苷适体的单链DNA与修饰了发光试剂和淬灭剂的两条单链DNA杂交，形成DNA逻辑门。加入单磷酸腺苷能与其适体发生特异性结合，将修饰了发光试剂的单链DNA竞争释放到溶液中，碳纳米管修饰的电极捕获单链DNA，电致化学发光信号增强；加入腺苷脱氨酶可以催化单磷酸腺苷脱氨基，改变单磷酸腺苷的结构，破坏其与适体的结合，适体与修饰了发光试剂的单链DNA形成杂交体，脱离碳纳米管修饰的电极，电致化学发光信号降低。最终，利用碳纳米管修饰的电极进行电致化学发光输出信号分析。本发明进行了进一步的改进，通过猝灭基团的引入，降低了背景干扰，提高了检测的灵敏度。

本方法所用仪器装置为：Potentiotat/Galvanostat Model 263A电化学工作站(Princeton Applied Research；USA)；MPI-E型电致化学发光分析系统(西安瑞迈分析仪器有限公司)；三电极系统：玻碳电极为工作电极，Ag/AgCl为参比电极，铂丝为对电极；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器(巩义市英峪予华仪器厂)；pHS-25型酸度计(上海雷磁仪器厂)；BS124S电子天平(北京赛多利斯系统有限公司)；SZ-93自动双重纯水蒸馏器(上海亚荣生化仪器厂)；KQ-50B型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；电热恒温干燥箱。

所用试剂为：RuCl₃.xH₂O(上海久岳化工有限公司)；2，2-联吡啶(Alfa Aesar，A Johnson Mathcy Company)；NaPF₆(Alfa Aesar，A Johnson Mathcy Company)；2，2-联吡啶-4，4-二甲酸(苏州工业园区亚科化学试剂有限公司)；N，N-二环己基碳酰亚胺(国药集团化学试剂有限公司)；多壁碳纳米管(北京纳辰公司)；羧基二茂铁(金坛市思达化工有限公司)；单磷酸腺苷(AMP)、腺苷脱氨酶(AD)、乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸(EDC)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)均购自Sigma公司。实验所用试剂均为分析纯，水均为二次蒸馏水。

附图说明

图1为Ru(bpy)₂(dcbpy)的结构式；

图2为以AMP和AD为激发物的逻辑门操作过程示意图；