[发明专利]一种人子宫肌瘤14-3-3 γ高表达载体的构建方法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种人子宫肌瘤14-3-3 γ表达载体的构建方法及应用。

背景技术

子宫肌瘤是人体最常见的肿瘤之一，也是女性生殖器官最常见的肿瘤。据统计，30～50岁生育年龄的妇女中子宫平滑肌肿瘤的发病率高达20%～30%。近年来其患病率有逐年增加的趋势。虽然子宫肌瘤是良性肿瘤，却是导致生育年龄妇女子宫切除的首位原因，严重危害了妇女的生殖健康。子宫肌瘤的发生与雌、孕激素密切相关，但其发生发展的分子机制尚未明确。目前用来治疗子宫肌瘤的药物主要有促性腺激素释放激素类似物（GnRHa）和米非司酮，但是都存在停药后子宫肌瘤反跳性增大的危险。因此，深入探讨子宫肌瘤发生发展的分子机制，将为有效治疗子宫肌瘤提供新思路和实验依据。

14-3-3蛋白是一类高度保守的酸性蛋白家族，在所有的真核细胞中均有表达。目前已发现14-3-3蛋白在哺乳动物中有七种亚型，分别为：β、γ、ε、η、ζ、σ和τ。该蛋白能够与细胞内200多种蛋白质结合，参与细胞信号传导、周期调控、凋亡、分化、恶性转化、迁移等多种细胞生命活动，在肿瘤的发生发展中发挥多方面的作用。近年的研究表明，多种肿瘤的发生，包括乳腺癌、前列腺癌子宫内膜癌和卵巢癌等与14-3-3σ蛋白表达的降低/缺失密切相关。

在我们的前期研究中，率先应用双向凝胶电泳和电喷雾串联质谱技术研究子宫肌瘤和周围正常肌层组织的差异蛋白质，并采用RT-PCR和Western blot进一步验证，发现14-3-3γ在子宫肌瘤中的表达明显低于正常子宫肌层组织，但14-3-3γ在子宫肌瘤发生发展中的具体作用机制尚缺乏客观依据。

为此，本项目拟通过质粒转染技术，构建人子宫肌瘤14-3-3 γ高表达载体，探讨14-3-3γ对子宫肌瘤细胞增殖、凋亡的影响；为治疗子宫肌瘤提供新思路和实验依据。。

发明内容

本发明的目的在于提供一种人子宫肌瘤表达载体的构建方法，探讨14-3-3γ对子宫肌瘤细胞增殖、凋亡的影响，为子宫肌瘤的治疗提供新思路和实验依据。

为了实现上述目的，本发明公开了一种人子宫肌瘤表达载体的构建方法，其特征在于：选用pCMV-N-Flag为中间载体，设计一对引物，在引物中引入BamH I和EcoR I酶切位，以含有目的基因的RNA逆转录后为模板进行PCR扩增，将目的条带切下后，用试剂盒回收纯化，将纯化后的PCR产物和载体pCMV-N-Flag用BamH I和EcoR I双酶切后，用试剂盒回收纯化酶切产物，再经连接片段、筛选培养、克隆，即可得人子宫肌瘤表达载体。所述构建方法步骤如下：

1）设计引物

根据待扩增的目的基因序列，设计一对如下引物：

14-3-3γ 前引物序列 CGCGGATCCATGGTGGACCGCGAGCAACTG

14-3-3γ 后引物序列：CCGGAATTCTTAATTGTTGCCTTCGCCGC

2）以含有目的基因的RNA逆转录后为模板，用上述一对引物和DNA聚合酶进行PCR扩增，用试剂盒纯化得到扩增产物；

3）pCMV-N-Flag载体扩增及双酶切

将pCMV-N-Flag载体用BamH I和EcoR I进行双酶切，BamH I 切割位点： G↓GATCC ；EcoR I 切割位点： G↓AATTC；

4）基因重组

将步骤2）得到的扩增产物与步骤3）得到的经过双酶切的pCMV-N-Flag载体进行片段连接，再经筛选培养、克隆，即可得所述人子宫肌瘤表达载体。

本构建方法的优点和特点：通过本设计人子宫肌瘤14-3-3 γ高表达载体的构建，为研究14-3-3 γ对细胞的增殖和凋亡提供可靠的依据，以及其在细胞内的表达、定位、功能提供了直观便捷的工具；此外，pCMV-N-Flag载体及BamH I和EcoR I等试剂购买方便，制备过程简单有效，操作方便，合成产物筛选方便，重组体稳定。

下面结合附图及具体实施例对本发明作进一步说明。

附图说明

附图1为本发明重组载体构建示意图；

附图2为pCMV-N-Flag质粒扩增后提取DNA，琼脂糖凝胶电泳结果示意图；

附图3为PCR扩增14-3-3γ基因后提取纯化，琼脂糖凝胶电泳结果示意图；

附图4为载体及目的基因双酶切后，琼脂糖凝胶电泳结果示意图；

附图5为载体与目的基因连接后，对重组基因进行扩增，提取质粒筛选重组载体示意图；