[发明专利]含ica基因座的奶牛乳房炎来源表皮葡萄球菌的非诊断性检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及利用多重PCR技术检测含ica基因座的奶牛乳房炎来源表皮葡萄球菌的检测方法，该技术可以用于疾病诊断目的的检测，也可以用于非疾病诊断目的的检测。

背景技术

表皮葡萄球菌是人和动物常见的条件性致病菌。近几年来，由能形成生物膜的表皮葡萄球菌导致的慢性及亚急性感染已经成为医院内感染的主要来源，因此人们认为生物膜形成能力是衡量表皮葡萄球菌致病性大小的一个重要方面。而胞外多糖粘附素PIA是表皮葡萄球菌生物膜形成的主要因素，由ica基因座负责合成。在奶牛养殖业中，奶牛乳房炎已经成为制约本行业健康发展的主要因素，尤其是慢性和隐性乳房炎，由于其疗程长、治疗费用高，同时导致牛奶长期废弃等原因，已经引起人们的高度重视。而现代研究结果表明，病原菌在乳房组织形成生物膜，是导致慢性和隐性乳房炎难以治愈且反复发作的重要原因。因此，建立一种快速检测能形成生物膜病原菌的方法，可为临床治疗由生物膜感染引起的疾病提供理论依据。

本发明利用多重PCR方法建立了一种快速检测技术，以筛选和鉴定含有ica基因座的奶牛乳房炎来源表皮葡萄球菌。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供一种含ica基因座的奶牛乳房炎来源表皮葡萄球菌的非诊断性检测方法。

本发明的技术方案如下：

一种含ica基因座的奶牛乳房炎来源表皮葡萄球菌的非诊断性检测方法，用于多重PCR扩增的三对引物序列为SEQ ID NO：1-6；引物SEQ ID NO：1-4的工作浓度均为0.2μmol/L，扩增16SrDNA片段的引物SEQ ID NO：5-6浓度为0.04μmol/L；多重PCR反应体系中含有该六条引物，PCR反应条件为：94℃5min，随后的30个循环中，每个循环包括如下反应：94℃30s，55℃1min，72℃1min；最后72℃延伸10min；含有ica基因座的表皮葡萄球菌能扩增出三种基因片段：16SrDNA、ica基因座及表皮葡萄球菌特异性片段。

本发明将扩增16SrDNA、ica基因座及表皮葡萄球菌特异性片段的三对引物在同一个PCR体系中进行扩增，优化条件后，使含有ica基因座的表皮葡萄球菌能扩增出三种基因片段(16SrDNA、ica基因座及表皮葡萄球菌特异性片段)，而不含有ica基因座的表皮葡萄球菌能扩增出两种基因片段(16SrDNA和表皮葡萄球菌特异性片段)，其它细菌只能扩增出一种基因片段(16SrDNA)，从而筛选出含有ica基因座的表皮葡萄球菌。

附图说明

图1.icaAB部分片段(icaAB-F-Se、icaAB-R-Se)PCR扩增结果；泳道1：阳性对照表皮葡萄球菌ATCC35984，泳道2-3：待检表皮葡萄球菌，泳道4：阴性对照表皮葡萄球菌ATCC12228，泳道5：待检金黄色葡萄球菌；

图2：表皮葡萄球菌特异性片段(SE705-1、SE705-2)PCR扩增结果；泳道1：546bp和124bp分子量标准，泳道2-3：表皮葡萄球菌ATCC35984和ATCC12228，泳道4-7：待检表皮葡萄球菌，泳道8：待检金黄色葡萄球菌；

图3：细菌通用引物(UNB1、UNB2)PCR扩增结果；泳道1-2：表皮葡萄球菌ATCC35984和ATCC12228，泳道3-6：待检表皮葡萄球菌，泳道7：待检金黄色葡萄球菌，泳道8-10：非葡萄球菌；

图4：本发明的含ica基因座的表皮葡萄球菌多重PCR结果；泳道1：表皮葡萄球菌ATCC35984(ica⁺)，泳道2：待检表皮葡萄球菌，泳道3：表皮葡萄球菌ATCC12228(ica^-)，泳道4：待检金黄色葡萄球菌。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。

一材料与方法

1、细菌分离与鉴定

采自不同奶牛场的乳样作为检测样品，先采用兰州乳房炎检测试验(LMT)进行隐性乳房炎检测，然后从阳性乳样中分离细菌，用于后续生物膜形成实验和PCR检测。细菌的分离与鉴定采用传统的生理生化手段，包括使用常规的培养基、形态学观察、生化试验等，生化试验包括凝固酶试验、脲酶试验和糖发酵试验等。16SrDNA测序技术也用于鉴定细菌。

2、生物膜形成实验