[发明专利]源于雷氟松氏菌的短链脱氢酶、编码基因、载体、工程菌及应用

权利要求书

1.一种来源于雷氟松氏菌（Leifsonia xyli HS0904）的短链脱氢酶基因，其特征在于所述基因具有与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列90%以上同源性。

2.如权利要求1所述来源于雷氟松氏菌（Leifsonia xyli HS0904）的短链脱氢酶基因，其特征在于所述基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。

3.一种由权利要求1或2所述短链脱氢酶基因编码的短链脱氢酶。

4.如权利要求3所述短链脱氢酶具有与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列95%以上同源性。

5.如权利要求4所述短链脱氢酶，其特征在于所述短链脱氢酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。

6.一种含有权利要求1所述短链脱氢酶基因的重组载体。

7.一种由权利要求6所述重组载体构建的重组基因工程菌。

8.一种权利要求1所述短链脱氢酶基因在构建短链脱氢酶中的应用，其特征在于所述应用为：构建含有所述短链脱氢酶基因的重组载体，将所述重组载体转化至大肠杆菌中，对获得的重组基因工程菌进行诱导培养，从培养液中分离得到含有重组短链脱氢酶的菌体细胞。

9.一种权利要求3或4所述短链脱氢酶在制备手性醇中的应用，其特征在于所述的应用为：以含短链脱氢酶基因的重组工程菌经发酵培养获得的菌体细胞或菌体细胞再经超声破碎、分离纯化后获得的酶液作为酶源，分别加入pH值为6.0～9.0的缓冲溶液、底物和/或异丙醇和/或辅酶NADH构成不对称还原反应体系，在20～37℃、100～300rpm条件下振荡反应1～4h，反应结束后，反应液用含十二烷的正己烷萃取，离心，取上层有机相，获得含所述手性醇的粗品；所述底物为3,5-双三氟甲基苯乙酮、对三氟甲基苯乙酮、4-羟基-2-丁酮、乙酰乙酸乙酯、4-氯乙酰乙酸乙酯或乙酰乙酸叔丁酯；所述底物的初始浓度为0.5～300g/L反应体系，所述酶源以菌体细胞形式加入时，酶源的用量以湿菌体质量计为20～300g/L反应体系，所述酶源以酶液形式加入时，酶源的用量以酶液体积计为0.1～0.2mL/2mL反应体系，酶液比活力为3.58U/mL，所述异丙醇质量终浓度为0～50%，所述辅酶NADH加入量为0～10mmol/L反应体系。

10.如权利要求9所述雷氟松氏菌短链脱氢酶在制备手性醇中的应用，其特征在于所述酶源按如下方法之一制备：（1）湿菌体：将含短链脱氢酶基因的重组工程菌接种至含50μg/ml卡那霉素的LB培养基中培养，20～37℃、100～200rpm振荡培养6～12h，将培养液以体积比1:100接种至新鲜的含50μg/ml卡那霉素的LB培养基中，37℃、200rpm振荡培养至培养液的OD₆₀₀达到0.6～0.9时，向培养液中加入终浓度为0.1～1.5mmol/L的IPTG，20～37℃、200rpm继续诱导培养6～12h，将所得培养液离心，收集湿菌体，即为酶源；（2）酶液：将含短链脱氢酶基因的重组工程菌经发酵培养获得的湿菌体加入50mM、pH7.5的Tris-HCl缓冲液中进行超声波破碎，得到粗酶液，超声处理条件为：超声处理2s后，间歇5s，反复处理共30min；将粗酶液先经DEAE-Sepharose离子交换层析，以pH7.5、含0～1M NaCl的Tris-HCl缓冲液为洗脱剂进行梯度洗脱，收集含有酶活的洗脱液a，将洗脱液a进行Octyl-Sepharose疏水层析，用pH7.5、含0.5～0M硫酸铵的Tris-HCl缓冲液进行梯度洗脱，收集含有酶活的洗脱液b，将洗脱液b进行High Q离子交换层析，用pH7.5、含0～0.5M NaCl的Tris-HCl缓冲液进行梯度洗脱，收集含有酶活的洗脱液c，将洗脱液c进行Superdex 200凝胶过滤层析，用50mM、pH7.5的Tris-HCl缓冲液洗脱，收集含有酶活的洗脱液d，得到所述酶液，即酶源。