[发明专利]一种合成短单链脱氧核糖核苷酸探针的方法

权利要求书

1.一种合成短单链脱氧核糖核苷酸探针的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）制备重组有模板DNA的质粒

设计模板DNA序列：模板DNA为双链，两端含有相同的酶切位点；模板DNA设有至少一个颈环-探针结构；模板DNA还带有切口酶位点。合成所述的模板DNA并连接至质粒中，经测序验证无突变并扩增；

（2）酶切并连接模板DNA

从重组质粒上酶切获得模板DNA，使模板DNA首尾连接成环；

（3）切单链，滚环复制

用切口酶切断模板DNA的一条链，加入DNA聚合酶以环状带切口的DNA为模板进行滚环复制，扩增出含颈环-探针结构的DNA单链；

（4）目的短单链DNA的制备

对步骤（3）的自发形成颈环二级结构的DNA单链产物采用内切酶切割形成与微RNA完全互补的目的单链DNA探针和副产物DNA，通过PAGE分离纯化得到含单一序列的无突变的单链DNA探针。

2.根据权利要求1所述的一种合成短单链脱氧核糖核苷酸探针的方法，其特征在于：颈环为含内切酶位点的可成环结构，探针为任何一个DNA序列；内切酶切割内切酶位点以在颈环和任何一个DNA序列之间切断。

3.根据权利要求2所述的一种合成短单链脱氧核糖核苷酸探针的方法，其特征在于：所述的探针为任一微RNA的反义序列；所述的内切酶切割内切酶位点以在颈环和任一微RNA的反义序列之间切断，切离出与微RNA序列完全互补的微RNA的反义序列。

4.根据权利要求2所述的一种合成短单链脱氧核糖核苷酸探针的方法，其特征在于：所述的内切酶为BtsCI或BspPI，所述的内切酶位点为BtsCI位点或BspPI位点内切酶与内切酶位点相对应。

5.根据权利要求1所述的一种合成短单链脱氧核糖核苷酸探针的方法，其特征在于：所述的切口酶位点包括Nt.BstNBI位点，所述的切口酶包括Nt.BstNBI。

6.根据权利要求1所述的一种合成短单链脱氧核糖核苷酸探针的方法，其特征在于：采用末端转移酶在纯化后的单链DNA探针端部加上标记物；或者在聚合酶扩增时加入带标记物的扩增底物。

7.根据权利要求4所述的一种合成短单链脱氧核糖核苷酸探针的方法，其特征在于：所述的标记物包括地高辛、荧光素、生物素或同位素。

8.根据权利要求1所述的一种合成短单链脱氧核糖核苷酸探针的方法，其特征在于：所述的目的单链DNA探针大小为10-30bp。

9.根据权利要求1所述的一种合成短单链脱氧核糖核苷酸探针的方法，其特征在于：所述的DNA聚合酶为phi29DNA聚合酶。