[发明专利]一种颅神经嵴源性干细胞的培养方法和鉴定方法

权利要求书

1.一种颅神经嵴源性干细胞的培养方法，其特征在于：采用sox-2基因从11～12天鼠胚颌突组织中分选所述颅神经嵴源性干细胞。

2.如权利要求1所述的颅神经嵴源性干细胞的培养方法，其特征在于：采用sox-2基因从11.5天鼠胚颌突组织中分选所述颅神经嵴源性干细胞。

3.如权利要求1或2所述的颅神经嵴源性干细胞的培养方法，所述采用sox-2基因是指采用带荧光sox-2+抗体标记细胞，在流式细胞仪上分选得到sox-2阳性细胞。

4.如权利要求1、2或3所述的颅神经嵴源性干细胞的培养方法，包括原代细胞获取与培养，sox-2+细胞的分选，其特征在于所述原代细胞的培养基为DMEM/F12培养基、10%胎牛血清（FBS）、5g/L碳酸氢钠、0.15g/L L-谷氨酰胺、100 IU/L青霉素。

5.如权利要求4所述的颅神经嵴源性干细胞的培养方法，所述原代细胞获取与培养，包括以下步骤：消化所述鼠胚颌突组织，使组织分散成细胞悬液，细胞筛过滤得到原代细胞并培养，其特征在于：所述细胞筛的孔径为75μm滤网。

6.如权利要求4或5所述的颅神经嵴源性干细胞的培养方法，所述原代细胞的培养条件为将所述原代细胞置入5%CO2培养箱，在37℃恒温下培养，培养至第2天换液，此后每1-3天进行一次全换液。

7.如权利要求4、5或6所述的颅神经嵴源性干细胞的培养方法，还包括将细胞悬液离心后，重悬，再过细胞筛，所述离心的转速为800～1000rpm，离心时间为3～5分钟。

8.如权利要求1所述的颅神经嵴源性干细胞的培养方法，包括以下步骤： 

(1)原代细胞获取与培养：在无菌条件下，切取妊娠11～12天鼠胚的颌突组织，剪碎后用0.25%胰酶/0.1mM的EDTA，消化5～10分钟，DMEM/F12培养基终止消化后吹打使组织分散成细胞悬液，800～1000rpm离心3～5分钟，弃上清；加入含10%FBS的DMEM/F12培养基使细胞重悬后通过75μm细胞筛，将过滤后细胞悬液分装入培养瓶中；沿培养皿边缘加入10%FBS的DMEM/F12培养基，置入5%CO2培养箱，在37℃恒温下培养，培养至第2天换液，此后每1-3天进行一次全换液;

(2)sox-2+细胞的分选：细胞铺满瓶底时，0.25%胰酶/0.1 mM的EDTA消化30秒，10%FBS的DMEM/F12培养基终止消化，吹打使细胞分散悬浮，800～1000rpm离心3～5分钟，弃上清；加入0.01 M的PBS洗涤，800～1000rpm离心3～5分钟；加入1：50的带荧光sox-2+抗体标记和PBS共500mm，在5%CO2 、37℃培养箱乳化1 h；PBS洗涤，在流式细胞细胞仪上进行分选，将获取sox -2+细胞继续培养传代。

9.一种颅神经嵴源性干细胞的鉴定方法，采用p75NTR鉴定细胞的神经嵴源性，采用CD29, CD44, CD90, CD105, Stro-1鉴定细胞的干细胞特性，诱导脂肪、诱导成骨、诱导成软骨和诱导神经分化鉴定细胞多向分化特性。

10.如权利要求9所述的颅神经嵴源性干细胞的鉴定方法，包括以下步骤：

(1).待鉴定细胞铺满瓶底时，采用0.25%胰酶/0.1 mM的EDTA 消化30秒，10%FBS的DMEM/F12培养基终止消化，吹打使细胞分散悬浮，800～1000rpm离心3～5分钟，弃上清；加入PBS洗涤，再次离心，弃上清，4%多聚甲醛固定20分钟，加入PBS洗涤，离心，弃上清；1% BSA-PBS封闭30分钟，PBS洗涤，离心，弃上清；采用带荧光p75^NTR抗体（1﹕100）标记细胞，过夜，在流式细胞仪上根据不同象限计算细胞阳性率；

(2).步骤（1）得到的p75^NTR阳性颅神经嵴源性干细胞，铺满瓶底时，采用0.25%胰酶/0.1 mM的EDTA 消化30秒，10%FBS的DMEM/F12培养基终止消化，吹打使细胞分散悬浮，800～1000rpm离心3～5分钟，弃上清；加入PBS洗涤，再次离心，弃上清，4%多聚甲醛固定20分钟，加入PBS洗涤，离心，弃上清；1% BSA-PBS封闭30分钟，PBS洗涤，离心，弃上清；加入CD29, CD44, CD90, CD105, Stro-1, p75一抗（1：100）过夜，加入PBS洗涤，再次离心，弃上清；加入荧光2抗（1：800）乳化1小时，流式细胞仪检测阳性率；

(3).步骤（2）得到的阳性颅神经嵴源性干细胞以1×10⁵接种至6孔板内，分别加入脂肪诱导培养液、成骨诱导培养液、成软骨诱导培养液和神经分化诱导液，观察干细胞的多系谱分化特性。