[发明专利]一种蓝耳病亚单位疫苗的制备

说明书

技术领域

本发明属于生物技术基因工程领域，主要涉及一种猪蓝耳病亚单位疫苗制备与应用。具体地，利用基因重组技术，将主要结构蛋白GP5串联，并克隆入载体，转化宿主菌，经过发酵，纯化、乳化工艺制备，得到重组蓝耳病亚单位疫苗以及该疫苗在预防重大动物疾病猪蓝耳病中的应用。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征(porcinere productive and respiratory syndrome，PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcinere productive and respiratory syndrome virus，PRRSV)引起的猪病毒性疾病，以妊娠母猪繁殖障碍和仔猪的呼吸道疾病及免疫抑制和持续性感染为特征，是近年来引起世界养猪业严重经济损失的重要疾病之一(Terpstra et al.1991)。现在PRRSV几乎在所有的养猪国家都流行(Bilodeau et al，1991；Wensvoort et al，1991；Albina et al，1997)。目前针对该病的防控，疫苗免疫仍然是一个主要的途径之一(梁皓仪，2008)。

PRRSV基因组大小为15kb左右，含有8个开放阅读框架(ORFs)，其5’末端有帽子结构，3’末端有一个Poly(A)尾巴。GP5(E蛋白)具有中和表位，为病毒的主要免疫保护型抗原；PRRSV与EAV同为马动脉炎病毒科成员，GP5的生物学功能非常重要，主要在病毒感染、细胞结合及病毒吸附中起作用，也是淋巴细胞增生性应答的靶点。

GP5蛋白是PRRSV病毒的主要囊膜糖蛋白，是病毒的重要的中和抗原(Pirzadeh et al.，1998；Gonin et al.，1999)，可以刺激机体产生中和抗体和细胞免疫，另外，针对GP5蛋白的单克隆抗体也被证实具有病毒中和活性。GP5有6个抗原决定簇，3个B细胞表位，能诱导机体产生中和抗体(Plagemann，2004)，是PRRSV所有结构蛋白中产生中和抗体最强的结构蛋白，GP5诱导产生的中和抗体效价与对病毒的保护是呈显著的相关性；GP5的另一重要作用是可诱导细胞凋亡(Fernidez et al.，2002)。用表达GP5的基因工程疫苗免疫猪，可以产生针对PRRSV的中和抗体(Pirzadeh and Dea，1997；Zhanget al.，1998)，而且免疫猪攻毒后可以得到有效的保护，比如缓解病毒血症和减轻肺部损伤(Pirzadeh et al，1998；Xue et al.，2004；Qiu et al.，2005)。有研究人员对6株“高热综合病”RRSV变异株的GP5的同源性进行对比，表明同源性较高，均位于同一个独立的分支中。现行疫苗株RespPRRS/Repro MLV，PrimePac，IngeIvacATP和CH-1 a分别位于不同的分支中。在高致病性蓝耳病的GP5中，中和表位的抗体结合位点的39位氨基酸发生了比较一致的突变。且在9，16，35，39，58，94及185为氨基酸发生了比较一致的突变，与先前的疫苗株和国内流行株有明显的差异。所有高致病性PRRS分离株的13位和151位的氨基酸都为R，表现为强毒类型(Ansari IH，2006)。GP5蛋白含有多个中和表位，用重组GP5蛋白制备的单克隆抗体具有中和活性，病毒中和作用与抗GP5抗体效价呈显著相关性。针对GP5的单克隆抗体的中和活性比针对其它蛋白如GP4蛋白的单克隆抗体更强。研究表明，GP5蛋白至少包含两种类型的中和抗原决定簇，一些为线性决定簇，可以与大肠杆菌表达的重组GP5蛋白反应，还有一些为构象依赖性决定簇(KreutzLC，1997；PirzadehB，1998；Weiland E，1999；Zhang Y，1998)。