[发明专利]一种制备鲆鲽鱼类单个胚胎染色体的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术中的海洋动物细胞遗传学领域，具体涉及一种适用于鲆鲽鱼类单个胚胎的染色体制备方法。

背景技术

鲆鲽鱼类隶属于硬骨鱼纲(Osteichthyes)，鲽形目(Pleuronectiformes)，俗称比目鱼类(Flatfishes)，可分为鲆科(Bothidae)、鲽科(Pleuronectidae)和鳎科(Soleoidae)。鲆鲽鱼类是中国海水鱼养殖种类中重要的组成部分，其肉质鲜美细嫩，营养丰富，具有极高的营养价值和经济价值。

随着海洋脊椎动物细胞遗传学的不断发展，鲆鲽鱼类的染色体制备技术已经比较成熟，使用鳃丝、肾脏或细胞培养等手段可以比较方便地制备鲆鲽鱼类的染色体并进行相关的核型、带型和荧光原位杂交等分析。但是，目前利用鲆鲽鱼类胚胎为材料制备染色体的方法比较粗糙。简而言之，就是把十几个胚胎放在玻片上挤碎，然后按常规染色体处理方法进行。这样的结果就是分裂相太少，材料浪费很大，做出来的是多个个体的染色体，而且由于卵黄比较多，分裂相的效果非常不好，严重影响了后续的分析。为了能够满足对鲆鲽鱼类胚胎时期细胞遗传学分析的要求，迫切需要开发出一种能够应用于鲆鲽鱼类单个胚胎的染色体制备技术，使制备的染色体分裂相数目足够多，效果好，且不容易造成胚胎材料的浪费。

发明内容

本发明的目的是提供一种制备鲆鲽鱼类单个胚胎染色体的方法，使用该方法制备的染色体分裂相数目多，不会造成胚胎材料的浪费，最关键的是可以针对单个胚胎来制备染色体。

本发明一种制备鲆鲽鱼类单个胚胎染色体的方法，按照下述步骤进行：

使用鲆鲽鱼类的胚胎为材料，先以注射器为工具，采用物理加压的方法对胚胎材料卵膜的破除，将处于尾牙期至出膜期之间的胚胎连同海水一起置于针筒中，然后推动注射器活塞将胚胎自针头处挤压出，胚胎即可破膜，且组织保存较完整。破膜后的胚胎使用常规染色体制备方法进行染色体的制备，用质量与体积比为0.005%的秋水仙素处理2小时，然后置于浓度为0.075mol/L KCl的低渗液中处理30分钟，最后用体积比为3：1的乙醇和冰醋酸组成的卡诺固定液固定三次，每次20分钟。

本发明使用的材料为鲆鲽鱼类的胚胎，具体的发育时期为从尾牙期tail-bud stage (受精后发育约50h，不同孵化条件、不同种类的鲆鲽鱼会有差异)到出膜期hatching stage (受精后发育约90h，不同条件和种类会有差异)的胚胎。

本发明使用的注射器针头型号为4.5—7，即针头直径为4.5mm—7mm。

本发明获得的鲆鲽鱼类染色体分裂相非常多，效果也很好，尤其是可以制备单个胚胎的染色体，不浪费材料，且可以针对单个个体进行后续的遗传学分析。

附图说明

图1：使用常规的方法得到的鲆鲽鱼类染色体分裂相；

图2：使用本发明方法得到的鲆鲽鱼类染色体分裂相。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细的描述。

实施例一、使用本发明方法对牙鲆胚胎进行染色体制备

选择进入出膜期的牙鲆（Paralichthys olivaceus，属于鲽形目，鲆科，牙鲆属）胚胎为材料，将其连同孵育的海水一起置于针筒中，然后推动注射器活塞将胚胎自针头处挤压出。破膜后的胚胎置于0.005%（质量体积比）的秋水仙素中处理2小时，再放入0.075mol/L KCl低渗液中处理30min，最后用卡诺固定液（乙醇：冰醋酸=3：1，体积比）固定3次，每次20min。

对比例：使用常规的方法对牙鲆胚胎进行染色体制备

以牙鲆胚胎为材料，选取十枚胚胎置于载玻片上，利用另一张载玻片挤压，使胚胎破膜。破膜后的胚胎置于0.005%（质量体积比）的秋水仙素中处理2小时，再放入0.075mol/L KCl低渗液中处理30min，最后用卡诺固定液（乙醇：冰醋酸=3：1，体积比）固定3次，每次20min。

三、两种方法的比较

1、制备过程。常规的方法利用玻片挤压后，胚胎会四处飞溅，且大多数细胞仍会被卵膜包被，不利于后续的处理。本发明的方法，处理后的胚胎可以直接用容器收集，且破膜彻底。

2、染色体分裂相的数目和质量。常规的方法制备的染色体分裂相数目不多，质量好的更少（图1）。本发明的方法制备的染色体分裂相数目非常多，质量也很好（图2）。

本发明获得的鲆鲽鱼类染色体分裂相非常多，效果也很好，尤其是可以制备单个胚胎的染色体，不浪费材料，且可以针对单个个体进行后续的遗传学分析。