[发明专利]一种用于检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的间接竞争ELISA免疫试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及生物疫苗制备技术领域，具体涉及一种用于检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的间接竞争ELISA免疫试剂盒。 

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）在全球范围内对养猪业造成了巨大的经济损失。该病于20世纪八十年代首次几乎同时出现在德国和美国，此后，PRRS在全球范围内爆发和流行。2006年春，在中国中部暴发的“无名高热”即猪高致病性猪繁殖与呼吸综合征（highly pathogenic PRRS ，PHFD）以高达20%～100%的死亡率引起了社会广泛的关注。 

猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）是导致该病主要病原。其属于动脉炎病毒科，动脉炎病毒属。各种年龄的猪均易感，妊娠母猪感染后可引起流产、死胎、木乃伊胎及弱胎，仔猪可发生呼吸障碍和高病死率，其他猪常呈隐性感染或仅出现轻度的呼吸道症状。PRRS病毒包括欧洲型和美洲型两种主要抗原型，分别以LV和VR-2332为代表株，型间具有明显的抗原交叉反应性。具有63%左右的同源性。由于其对养猪业的严重威胁性，国际兽疫局（1996）已将本病例为B类传染病。 

目前检测PRRSV的方法主要有病毒分离鉴定、间接免疫荧光试验和血清中和试验等诊断方法。以上技术要么工作量太大，要么要操作活病毒，要么特异性和敏感性不足，要么诊断时间过长，影响了疫病控制，要么不能够方便的进行临床检测。因此，开发一种具有特异性、敏感性良好，适用于临床检测，劳动强度不高，检测时间较短，检测费用较低的抗体检测试剂盒具有良好的应用价值和市场价值。 

发明内容

本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了一种猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体间接竞争ELISA检测试剂盒，通过标记的PRRSV单克隆抗体、标准血清和包被抗原，能够简单快速准确定量的检测猪血清中猪繁殖与呼吸综合征病毒中和抗体效价。 

为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：一种检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的间接竞争ELISA免疫试剂盒，所述试剂盒包括抗猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体的酶标记物。 

进一步的，上述的一种检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的间接竞争ELISA免疫试剂盒，所述试剂盒还包括已包被抗原的酶联板、标准血清、TMB显色液、终止液和PBST洗涤液。 

进一步的，上述的一种检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的间接竞争ELISA免疫试剂盒，所述已包被抗原的酶联板中，包被抗原为： 

利用猪繁殖与呼吸综合征病毒的部分或全部核蛋白基因的原核表达系统表达的纯化产物，或

利用猪繁殖与呼吸综合征病毒的部分或全部核蛋白基因的CHO-K1细胞表达的纯化产物。

进一步的，上述的一种检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的间接竞争ELISA免疫试剂盒，所述抗猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体为抗猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株NA N002，相关单抗见论文文献《猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白重组抗原及单克隆抗体的制备及鉴定》（中国农业科学院研究院，王猛，2011年6月，硕士论文，分类号S855.3）腹腔接种BALB/C小鼠后纯化的腹水。 

上述抗猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株NA N002，申请人已提供了提供了保证从申请日其二十年内向公众发放该细胞株的证明。 

本发明的第二个目的是提供了一种检测血清中猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体效价的方法，包括以下步骤： 

取待检猪血清50μl，在EP管中混合等量的酶标单克隆抗体，加入96孔板中，37℃反应1 h，取出弃掉反应液，加PBST洗涤3遍，每次3分钟，加入TMB显色液，37℃显色15min，取出加入100μl的反应终止液，在酶标仪上读取OD450数值。

其中，包被抗原可以是猪繁殖与呼吸综合征病毒的部分或全部核蛋白的原核表达系统重组蛋白或真核表达系统表达的部分或全部重组核蛋白。 

其酶标抗体指的是抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的NA N002 单克隆抗体。 

    使用的已知效价的标准血清，指的是猪繁殖与呼吸综合征病毒免疫猪后收获血清后，与WHO和OIE标准血清比对标定，用于标准曲线绘制的标准血清。 

使用的标准血清，来自猪的猪繁殖与呼吸综合征病毒的抗血清。 

具体制备过程为： 

1、包被抗原的制备和包被,包被抗原大小和特异性见图1：

包被抗原包括以下2类：