[发明专利]Apidaecin型抗菌肽在毕赤酵母菌中的表达及扩大培养

权利要求书

1.Apidaecin型抗菌肽在毕赤酵母菌中的表达方法，步骤如下：

（1）、Apidaecin型抗菌肽的修饰；

（2）、构建表达载体；

（3）、酶切重组质粒，电击转化毕赤酵母感受态细胞；

（4）、Apidaecin型抗菌肽的表达。

2.根据权利要求1所述的表达方法，其特征在于：步骤（1）中所述修饰是在5’端加入Kex2信号肽酶的切割识别位点，整个基因前后分别加入XhoI和Not I位点。

3.根据权利要求1所述的表达方法，其特征在于：步骤（3）中所述电击转化的条件为：电压为：1.5kv,电击4ms，电击一律在冰上进行；电击完毕后，放置于0℃预冷过的质量浓度为60%的山梨醇溶液中。

4.根据权利要求1所述的表达方法，其特征在于：步骤（4）中Apidaecin型抗菌肽的表达是先用BMGY培养基进行培养，离心将菌体重悬后，再在摇床上继续培养。

5.根据权利要求4所述的表达方法，其特征在于：所述BMGY培养基的配比为：质量百分数为2％的蛋白胨，1％的酵母提取物，100mmol/L的磷酸钾缓冲液，1.34％的酵母氮碱基，0.4μg/mL的维生素H，1％的甘油，其余为ddH₂O；其中，100mmol/L磷酸钾缓冲液在加入培养基前调pH至6.0；

 其制备方法为：除维生素H、酵母氮碱基外，将上述试剂依次加入，混匀，灭菌；待培养基冷却后，加入除菌过滤后的维生素H、酵母氮碱基。

6.根据权利要求4所述的表达方法，其特征在于：是用BMGY培养基培养，培养至OD₆₀₀ =2-6。

7.根据权利要求1所述的表达方法，其特征在于：所述表达产物的浓度为40mg/L，纯度在95%以上。

8.根据权利要求4所述的表达方法，其特征在于：所述重悬是用BMMY培养基菌体；所述BMMY培养基的配方为：2％的蛋白胨，1％的酵母提取物，100mmol/L的磷酸钾缓冲液，1.34％的酵母氮碱基，0.4μg/mL的维生素H，体积浓度3%无水甲醇，其余为ddH₂O；其中，100mmol/L磷酸钾缓冲液在加入培养基前调pH至6.0；

    其制备方法为：除维生素H、酵母氮碱基外，将上述试剂依次加入，混匀，灭菌，待培养基冷却后，加入除菌过滤后的维生素H、酵母氮碱基。

9.根据权利要求4所述的表达方法，其特征在于：所述在摇床上继续培养时，每24h向培养基中添加体积浓度3%无水甲醇；培养96小时后停止培养。

10.毕赤酵母菌在Apidaecin型抗菌肽表达中的应用。