[发明专利]一种脐带间充质干细胞的微载体培养系统

说明书

技术领域

本发明是一种快速、有效和规模化获得脐带MSC的方法，具体地说是利用细胞微载体培养技术和特殊细胞因子作为培养体系而构成的无血清、规模化的提高获得脐带间充质干细胞得率、速度和质量，并根据不同的临床运用而开发出特殊的细胞保存液。

技术背景

间充质干细胞(MSC)是属于中胚层的一类多能干细胞，主要存在于结缔组织和器官间质中，其除了具有干细胞的多向分化潜能，还具有免疫调节功能、低免疫原性和易获取性等特点，目前已经受到临床上的广泛重视。近年来MSC已成为干细胞研究中的热点，在免疫疾病治疗、造血干细胞移植、组织工程、基因工程等领域具有较好的应用前景。但MSC的临床运用受到其获取的数量、质量和定向分化等技术方面的限制，目前还没有进行广泛的临床应用。因此建立稳定有效快速的MSC规模化培养系统具有极为重要的意义。

一般认为MSCs在骨髓组织中的含量最丰富，但是随着年龄的老化，自体骨髓中MSCs数目显著降低、增殖分化能力大幅度衰退，目前从脂肪、胚胎、羊膜液、胎盘、脐带血以及脐带等骨髓以外的组织中分离出MSC已经成为研究热点。其中脐带由于其易于获取，且脐带MSC细胞和骨髓MSC细胞具有相同的表型和分化潜能。

目前用于分离间充质干细胞的方法主要有4种，即流式细胞分选法、磁珠分离法、密度梯度离心法和贴壁筛选法。其中，贴壁筛选法，所获得的细胞形态均一，增殖速度快，生长状态稳定，且操作简便，成本低，有望成为较实用的生产方法。理论上MSC具有无限的增殖能力，但由于体外培养时MSC的未分化状态只能维持有限的时间，而且随着传代次数的增殖，MSC的增殖能力下降，形态也由长梭形变成宽大扁平，逐渐丧失多向分化的能力。贴壁生长由于受到培养容器的限制，需要多次胰酶的消化、传代和扩增，过程繁琐，容易污染，而且营养物和细胞代谢产物导致的培养环境不均一，不利于MSC的大规模培养。

目前好多研究表明，一些细胞因子可以促进细胞的增殖，如酸性成纤维细胞因子、肝素、VEGF和FGF-2等等。虽然，这些细胞因子均可以不同程度的增加的MSC的增殖能力，但其作用机制尚未完全阐明，对MSC的增殖和分化影响十分复杂，这给临床应用安全性评估带来困难。为了增加MSC的增殖能力，而加入后不考虑其分化潜能违背了MSC的临床意义。

1967年，Van Wezel率先用离子交换树脂DEAE-SephadexA-50制成微载体，用于培养细胞。微载体培养与单层细胞培养相比，为贴壁细胞提供了更大的培养表面积，从而使细胞的产量大大增加，而且易于控制，减少了污染的危险，使大规模生产成为可能。目前，采用微载体细胞培养系统在搅拌生物反应器内培养人的MSC细胞，以探索一种大量、快速的MSC培养方法已经成为一种趋势。微载体是直径在60～250μm的微珠。目前，还没有适用于MSC大规模培养的微载体培养系统及其专用培养基，多采用培养其它细胞的培养系统和一般的含有动物源性血清的普通培养基，这导致了以下几个问题：①凋亡细胞较多：这主要是由于常用的微载体系统在普通的旋转式生物反应器搅拌情况下产生的剪切力较大，对MSC细胞造成一定损伤；②收集细胞较为困难：由于MSC是贴壁生长的细胞，所以在普通的微载体培养体系下收集细胞时候需要用0.25％胰酶进行消化收集，而一些多孔的微载体培养的MSC收集就更为困难；③异源性蛋白：在一般培养条件下在培养基中均加有10％的胎牛血清。2010年，美国、欧盟等发达国家已全面停止在生物制药中应用血清。因此，在微载体细胞培养中采用无血清、无蛋白和化学成分限定培养基，成为细胞培养的研究热点。

我们改进了传统的微载体培养体系，采用了新材料的微载体介质，并运用波浪式生物反应器将少了传统培养过程剪切力对细胞的损伤，并且采用了微载体培养特制的无血清培养基，将少了在MSC收集过程中的细胞损失，极大的提高了MSC的得率和效率。本方法简单易行，更有利于用于生产实践。

发明内容

本发明的目的是提供一种微载体培养系统，以快速有效利用新生胎儿的脐带为资源获取脐带MSC以及快速MSC鉴定的方法。这套微载体培养系统具体包括如下内容：

1、肝素交联葡聚糖微载体：在传统的Cytodex3微载体制备过程中，增加按照变性胶原∶肝素(10∶1比例)混合与交联葡聚糖基架化学偶联。变性胶原层易被胰蛋白酶和胶原酶等多种蛋白酶消化，以便在用胰酶收集细胞时，能在维持细胞最大活性、功能和完整性的同时将细胞从微载体上分离出来。在微载体表面的肝素可以促进MSC细胞的增殖与生长。