[发明专利]一种金枪鱼碎肉多肽类血管生成抑制因子及其制备方法和用途

说明书

技术领域

本发明涉及一种金枪鱼碎肉多肽类血管生成抑制因子，本发明还涉及该金枪鱼碎肉多肽类血管生成抑制因子的制备方法，本发明还涉及该金枪鱼碎肉多肽类血管生成抑制因子的用途。

背景技术

血管生成在人体发育、组织修复等正常生理过程中发挥重要作用，也是肿瘤等多种的重要病理特征之一。美国哈佛医学院教授Folkman认为肿瘤的生长依赖于新生血管的生成，可以通过抑制肿瘤的血管生成达到治疗肿瘤的目的。目前，这一观点已为大量的实验所证实，而以血管为靶点治疗肿瘤的药物----肿瘤血管生成抑制剂（tumor angiogenesis inhibitor，TAI）也成为研究的热点。

金枪鱼是世界远洋渔业的重要作业鱼种之一，年产量超过600万吨，占公海渔业总产量的70%以上。在金枪鱼加工过程中产生的暗色肉、内脏、鱼头和鱼皮等下脚料约占总重量50%～70%。研究发现金枪鱼下脚料中粗蛋白含量比较高，是良好的蛋白质来源，利用金枪鱼下脚料中的蛋白质可以生产多种具有生理活性的多肽，如降血压肽、抗氧化肽、免疫肽等。

但是，申请人研究发现，以金枪鱼下脚料碎肉为原料，利用酶解技术制备多肽类血管生成抑制因子的工艺研究处于空白阶段，而以金枪鱼下脚料碎肉酶解物为材料制备高活性多肽类血管生成抑制因子及其应用更是未见报道。 

发明内容

本发明所要解决的第一个技术问题是针对上述金枪鱼碎肉利用的技术现状提供一种金枪鱼碎肉多肽类血管生成抑制因子，该血管生成抑制因子能有效抑制鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）血管生成，对前列腺癌细胞DU-145的增殖也具有良好的抑制作用。

本发明所要解决的第二个技术问题是提供一种金枪鱼碎肉多肽类血管生成抑制因子的制备方法。

本发明所要解决的第三个技术问题是提供一种金枪鱼碎肉多肽类血管生成抑制因子在制备抑制血管生成、防治前列腺癌的药物中的应用。

本发明为解决上述第一个技术问题所采取的技术方案为：一种金枪鱼碎肉多肽类血管生成抑制因子，其特征在于该血管生成抑制因子的氨基酸序列为Trp-Val-Thr-Gly-Ile（WVTGI），ESI/MS检测给出分子离子峰m/z 575.42 Da（[M+H]⁺）。

本发明为解决上述第二个技术问题所采取的技术方案为：一种金枪鱼碎肉多肽类血管生成抑制因子的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1）取金枪鱼碎肉，按料液比1:3~1:5加入缓冲液，调节pH值至7.5~8.0，于35~40℃保温5-10 min，匀浆；

2）按照金枪鱼碎肉质量，加入胰蛋白酶 (trypsin)，加酶量为2000~2500 u/g，酶解温度为35~40℃，酶解时间4~6 h；酶解液升温至90~95℃，并于此温度保持10~15min后，使酶灭活；灭活酶解液9000~10000 r/min离心15~20 min，取上清液，冻干，得酶解产物。

3）将制备的金枪鱼碎肉酶解产物依次经超滤和层析，得到金枪鱼碎肉多肽类血管生成抑制因子。

作为优选，所述步骤1）中的金枪鱼为鲣鱼（Katsuwonus pelamis）。

作为优选，所述步骤1）中的缓冲液为pH为8.0的K₂HPO₄- KH₂PO₄缓冲液。

作为优选，所述步骤2）中的胰蛋白酶 (trypsin)的酶活力≥1.0 ×10⁴ u/g。

作为改进，所述步骤3）的超滤和层析的具体过程为：

超滤：将金枪鱼碎肉酶解产物溶于双蒸水，配成浓度为15~20 mg/mL的溶液，于0.1~0.15 MPa的工作压力和20~25 ℃的工作温度下采用1 kDa超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于1 kDa部分，冻干，即为超滤酶解物；