[发明专利]一种鉴定两系杂交水稻种子纯度的方法

说明书

技术领域

本发明属于农业生物工程技术领域，尤其涉及一种鉴定两系杂交水稻种子纯度的方法。

背景技术

植物雄性不育特性可由细胞质基因引起，称细胞质雄性不育(CMS)，也可因核基因突变引起，又名核基因雄性不育(GMS)。水稻是自花授粉作物，其杂种优势利用必须依赖于雄性不育性。在杂交水稻研究和应用之初，使用的雄性不育系都是CMS类型。1973年石明松在湖北晚粳稻品种农垦58群体中发现了自发突变的光周期敏感雄性不育(photoperiod-sensitive genic male sterile，PGMS)株，后来定名为农垦58S(石明松,中国农业科学,1985,2:44-48)，开启了利用光温敏雄性不育特性培育两系法杂交水稻的序幕。

经过几十年的研究，两系不育系根据其对光照长度和温度的敏感性可分为光敏不育(PGMS)、温敏不育(temperature-sensitive genic male sterility,TGMS)和光温敏核不育(P/TGMS)三类(程式华,中国农业科学,1996,29(4):11-16)。PGMS水稻具有长日照条件下抽穗雄性不育，短日照条件下抽穗雄性可育的基本特征，如农垦58S及其衍生的部分不育系。TGMS水稻在高温条件下抽穗雄性不育，低温条件下抽穗雄性部分可育，如安农S-1(邓华凤等,杂交水稻,1999,14(3):1-3)，广占63S(杨振玉等,杂交水稻,2002,17(4):4-6)，株1S(杨远柱等,杂交水稻,2000,15(2):6-9)等。PGMS和TGMS共同构成了目前生产上大面积应用的两系法杂交稻不育系基因的来源。

系谱分析表明大多早期商业化应用的P/TGMS系主要有3个起源：农垦58S，安农S-1和株1S(斯华敏等,作物学报,2012,38(3):394-407)。此外，不同的育种单位也相继育成了一些光温敏水稻不育系，如琼香1S(郭国强等,杂交水稻,2009,24(1):399-400)，绵9S(王志等,西南农业学报,1999,12(4):11-14)，雁农S(阳花秋等,杂交水稻,1996(1):9-10)等。在农垦58S衍生的后代中有些保持了光敏特性如玉兔S(赵海军等,中国水稻科学,2004,18(6):515-521)，而有些则表现为温敏特性如广占63S(杨振玉等,杂交水稻,2002,17(4):4-6)。大量遗传分析表明，PGMS和TGMS都受单隐性基因控制，如安农S-1(Yang等.Planta,2007,225:321-330)，株1S(杨远柱等,中国稻米,2007,(6):17-22)。

在两系杂交稻种子的生产过程中，除与三系杂交稻生产一样需要做好制繁种田的隔离，防止不同制繁种田之间以及与常规生产田的水稻出现花粉污染，造成种子纯度下降外，还需要特别注意避免因与异常天气如温度和日照长度造成不育系育性恢复的问题。为确保杂交种子纯度，一般需要在种子销售前开展种子纯度的田间或分子鉴定。

目前，我国杂交水稻杂种纯度鉴定的方法主要有3种：形态学鉴定法，同工酶和蛋白质电泳鉴定法，分子标记鉴定法。常规鉴定方法是抽样田间小区种植，进行形态观察，但是这种方法费时费力，易受环境影响，不利于种子的商品化销售，因此迫切需求杂种纯度鉴定的简易快速技术。

分子标记鉴定法在一定程度上简化了操作步骤，目前用于杂交水稻种子纯度的分子鉴定主要利用微卫星标记，已经建立起了标准化的通用技术体系(彭锁堂等，中国水稻科学，2003，17(1)：1-5；李召华等，杂交水稻，2006，21(4)：11-14)。但是，这一技术体系需要针对每个组合首先确定双亲的多态性分子标记，日后根据这些多态性标记的杂合性确定是不育系自交种还是杂交F₁种子。目前尚未建立起基于PGMS或TGMS基因差异的通用两系杂交种子纯度鉴定方法。

发明内容

本发明提供了一种鉴定两系杂交水稻种子纯度的方法，通用性强，简单方便，且鉴定结果准确可靠。

一种鉴定两系杂交水稻种子纯度的方法，包括：

(1)提取待检测种子或其长成的植株样品的基因组DNA；

(2)根据雄性核不育基因的功能性单核苷酸多态性位点，设计引物，进行PCR扩增；

(3)对PCR扩增产物进行特性分析，确定样品的基因型，计算得到种子样品的纯度。

本领域人员可以理解，功能性单核苷酸多态性位点即与表型直接相关的单核苷酸多态性位点，在该位点，单个核苷酸的变异可导致表型发生变化。