[发明专利]用于寡核苷酸合成的固相载体以及寡核苷酸合成方法

说明书

技术领域

本发明涉及用于寡核苷酸合成的固相载体。更具体地,本发明涉及用于寡核苷酸合成的固相载体，其通过将可裂解连接物负载在下述的多孔树脂珠上来获得，所述珠包括单乙烯基单体单元和可交联的乙烯基单体单元，并结合有聚乙二醇单元，且在该珠表面具有能够通过脱水缩合反应与羧基结合的基团。 

背景技术

采用亚磷酰胺(phosphoramidite)的固相合成方法被广泛地使用于寡核苷酸的化学合成。在该方法中,例如,首先，将待要合成的寡核苷酸的3'-端的核苷，经可裂解连接物例如琥珀酰基被预先负载在固相载体上，且将该载体放入反应柱并安装在寡核苷酸自动合成装置上。然后,根据寡核苷酸自动合成装置合成程序，例如下列方式，将合成用试剂送入反应柱中。(1)通过三氯乙酸/二氯甲烷溶液、二氯乙酸/甲苯等将核苷5'-OH基脱保护,(2)通过核苷亚磷酰胺(核苷单体)/乙腈溶液和活化剂(四唑或等)/乙腈溶液，将亚磷酰胺(amidite)与5'-OH基团偶合反应,(3)通过乙酸酐/吡啶/甲基咪唑/THF等将未反应的5'-OH基封上，以及(4)通过碘/水/吡啶等将亚磷酸盐氧化。 

通过重复上述合成循环,来合成具有目的序列的寡核苷酸。通过氨、甲胺等将可裂解连接物水解,将最终合成的寡核苷酸从固相合成载体切出(见非专利文献1)。 

到目前为止无机颗粒例如CPG(Controlled Pore Glass)、硅胶等被用作在寡核苷酸合成中使用的固相载体,但是近年来，由于平价并且大量合成，能够增加单位重量的固相载体的寡核苷酸合成量的树脂珠开始被使用。这些树脂珠,可以例举例如高度交联且非溶胀的多孔聚苯乙烯珠(见专利文献1),低度交联且溶胀的多孔聚苯乙烯珠(见专利文献2)等。 

通常,合成的寡核苷酸链越长，存在导致合成能力（合成纯度以及合成数量）越低的问题。为了解决该问题，需要减少作为固相载体合成起点的核 苷连接物的负载量。例如，可以通过具有约200μmol/g核苷连接物负载量的市售的多孔树脂珠固相载体，高纯度地合成包含20个碱基的DNA寡核苷酸。然而，对于包含40个碱基的DNA寡核苷酸，该负载量需要为80μmol/g或更少。同样，当合成RNA寡核苷酸或修饰寡核苷酸时，因为包含大的保护基或修饰基的亚磷酰胺(amidite)被偶合，合成寡核苷酸采用较低核苷连接物负载量，以防止合成能力降低。 

然而,当使用多孔树脂珠作为寡核苷酸合成的固相载体来合成寡核苷酸并且核苷连接物负载量减少时，出人意料地，存在使合成能力变得比预想的更低的问题。 

引用文献 

专利文献： 

专利文献1:JP-A-H3-68593 

专利文献2:JP-A-2005-325272 

专利文献3:JP-A-2008-74979 

非专利文献： 

非专利文献1:Current Protocol in Nucleic Acid Chemistry(2000),UNIT3.6Synthesis of Unmodified Oligonucleotide。 

发明内容

本发明解决的技术问题 

本发明目标在于提供用于高合成数量及高纯度合成寡核苷酸的固相载体。尤其,本发明目标在于提供采用低负载量连接物合成长链寡核苷酸、RNA寡核苷酸或修饰的寡核苷酸的固相载体。 

解决问题的手段 

本发明的发明人对于上述问题进行了深入研究，并且发现通过将聚乙二醇单元结合到用作寡核苷酸合成固相载体的多孔树脂珠上，即使采用低负载量的连接物，可以以高合成能力(高合成纯度及合成数量)地合成长链寡核苷酸、RNA寡核苷酸或修饰的寡核苷酸，结果完成了本发明。 

因此,本发明概要如下： 

(1)用于寡核苷酸合成的固相载体，其包括具有单乙烯基单体单元、可交联的乙烯基单体单元和聚乙二醇单元的多孔树脂珠和负载在其表面的可裂解连接物，该多孔树脂珠在其表面具有能够通过脱水缩合反应与羧基结合的基团，该可裂解连接物具有羧基，其中该可裂解连接物的羧基通过脱水缩合反应被结合到该能够与羧基结合的基团上，并且该可裂解连接物的负载量相对于该多孔树脂珠的重量为1-80μmol/g。 

(2)根据(1)所述的用于寡核苷酸合成的固相载体，其中该单乙烯基单体单元包括苯乙烯单体单元。