[发明专利]枯草芽孢杆菌L-天冬酰胺酶(ansZ)在大肠杆菌中的高效表达

说明书

技术领域

利用重组大肠杆菌高效表达B.subtilis6-7L-天冬酰胺酶，并首次对来源于枯草芽孢杆菌的L-天冬酰胺酶的酶学性质进行研究，属于基因工程和酶工程领域。

背景技术

L-天冬酰胺酶(EC3.5.1.1)即L-天酰胺酰胺基水解酶，能专一性地催化L-天冬酰胺水解生成天冬氨酸和氨。L-天冬酰胺酶是是一种有抗癌活性的蛋白酶，能专一催化L-天冬酰胺水解成天冬氨酸和NH3。L-天冬酰胺酶的生理作用主要表现为对某些肿瘤的抑制作用，尤其对急性白血病和恶性淋巴肿瘤有效。L-天冬酰胺酶已成为治疗白血病非常有效的药物，且对骨髓没有抑制作用。

L-天冬酰胺酶可以减少食物中丙烯酰胺的生成。丙烯酰胺主要是由食品原料中的还原糖和天冬酰胺在高温加热过程中通过美拉德反应生成，在食物中加入天冬酰胺酶可以水解天冬酰胺，从源头上减少丙烯酰胺的生成。

1922年Clamenti首先发现豚鼠血清中含有丰富的L-天冬酰胺酶，1953年Kiddd观察到豚鼠血清有破坏Gardner小鼠癌细胞6C3HED的作用，1961年Broome用层析法将豚鼠血清分离提纯后，在有抗癌活力的部分测出极高的L-天冬酰胺酶活力，1964年Mashbum和Wriston从Escherichia coli B中部分提纯了L-天冬酰胺酶，发现其同样具有抗癌作用。2004年Amrein等提出用L-天冬酰胺酶代替其他方法减少食物中丙烯酰胺含量。2009年Hendriksen等研究证明在高温处理食品时加入L-天冬酰胺酶不会产生危害，同时有众多学者通过具体的实验证明L-天冬酰胺酶可以降低炸土豆片、马铃薯干粉、面团等食物中丙烯酰胺的含量。目前美国、德国、日本等国均已有产品出售，1995年美国还将L-天冬酰胺酶作为抗癌新药开发。

L-天冬酰胺酶来源多样，一些微生物、哺乳动物及植物被证实含有L-天冬酰胺酶。Campbell等发现E.coli B中的L-天冬酰胺酶有EC-1和EC-2两种组分，仅具有相对热稳定性的EC-2组分有抗癌作用。Schwartz等人在E.coli K-12中也发现两种天冬酰胺酶：天冬酰胺酶I和II。Escherichia coli、Erwinia chrysanthemi、B.subtilis等均包含这两种L-天冬酰胺酶，研究证实仅L-天冬酰胺酶II具有抗癌作用，来自Escherichia coli和Erwinia chrysanthemi的L-天冬酰胺酶II已被开发为治疗急性淋巴细胞白血病的有效药物，目前研究的大部分是具有抗肿瘤效果的L-天冬酰胺酶II。

因为野生菌株L-天冬酰胺酶产量低，近年来随着基因工程技术的快速发展，利用基因工程技术构建L-天冬酰胺酶工程菌的报道日益增多，采用基因工程菌产L-天冬酰胺酶逐渐成为一个重要来源。

本发明通过分子生物学技术获得L-天冬酰胺酶基因，将其连接于表达载体上并转化大肠杆菌成功构建基因工程菌，实现L-天冬酰胺酶的高效表达，并对重组酶的酶学性质进行研究。发明内容

本发明的主要研究内容：本发明利用分子技术克隆了来自B.subtilis6-7的L-天冬酰胺酶基因(简称ansZ)，构建重组表达载体pGEX-6P-1-ansZ，并将其转化E.coli BL21，成功构建了基因工程菌pGEX-6P-1-ansZ/BL21，其酶活较原始菌提高了266倍。利用亲和层析法对表达的重组蛋白进行纯化，纯酶比酶活为56.30U/mg，并对该酶的酶学性质进行了研究，为该酶在食品及医药方面的应用提供一些理论基础。

本发明的技术方案：

1.L-天冬酰胺酶引物设计

根据NCBI枯草芽孢杆菌全基因组核酸序列中ansZ基因序列，设计L-天冬酰胺酶基因的PCR引物P1和P2。

P1：5’-GAC GGA TCC ATG AAAAAA CAA CGAATG CT-3’(BamHI)

P2：5’-GAC CTC GAG TTAATA CTC ATT GAAATAAG-3’(Xho I)

2.重组菌的构建