[发明专利]重组枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis产ADD的发酵策略

说明书

技术领域

重组枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis产ADD的发酵策略，尤其是一种大幅度提高重组菌中ADD产量的发酵条件优化策略，属于生物工程和酶工程领域。 

技术背景

甾体药物(steroid hormone drugs)是指分子结构中含有甾体结构的药物，其具有很强抗感染、抗过敏、抗病毒及抗休克的药理作用，是临床上一类重要的药物。主要分为二类药物：糖皮质激素和性激素。中国药典对甾体药物及其制剂的收录达97种。国内甾体药物的主要生产厂家有：仙琚制药集团、紫竹药业集团、佳尔科药业集团、神州药业集团等。近年来随着人们对生活质量、身体健康需求的日益提高以及当今社会日益加重的老龄化问题，甾体药物体现的价值日益显著。 

雄烯二酮(androstenedione)，又名Δ4-雄烯-3，17-二酮，是具有雄性激素作用的一种甾类化合物，是生产甾体药物重要的中间体。其性状是近白色结晶粉末，溶于乙醇，不溶于水。最常见的是雄甾-4-烯-3，17-二酮(AD)和雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮(ADD)。微生物降解植物甾醇产生许多重要的甾体类药物中间体，其中AD/ADD是最重要的甾体类药物中间体，可用于皮质甾体药物、盐皮质甾体类药物、常规避孕药及其它甾类药物的合成。AD/ADD每年市场的需求价值超过十亿美元。 

3-甾酮-Δ¹-脱氢酶(3-ketosteroid-Δ¹-dehydrogenase，KSDD或KSTD)也称C1，2位脱氢酶，它是甾体母核降解的关键酶，属于黄素蛋白酶类，位于细胞膜上，能在甾体母核C1和C2之间引入双键，提高原有底物的抗炎活性及经济价值，实现AD向ADD转化，在甾体药物开发上发挥着重要作用。对3-甾酮-Δ¹-脱氢酶(KSDD)的深入研究对整个甾体药物行业的发展意义深远。生产更高附加值的ADD最直接有效的方法就是以4-AD为底物，通过微生物产生3-甾酮-Δ¹-脱氢酶来实现4-AD到ADD的一步转化。 

本实验室前期成功构建了一株重组枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis168/pMA5-ksdD，实现了来源于新金色分枝杆菌Mycobacterium neoaurum的KSDD基因在模式菌株枯草芽孢杆菌168中的表达，并对该重组菌中的KSDD酶进行了功能鉴定与分析(专利：一种利用重组Bacillus subtilis全细胞转化AD生成ADD的方法；申请号：201210210431.1)。经过酶活测定，酶活达1.75U/mg，全细胞转化AD，12h后转化率达65.7％。分枝杆菌KSDD在枯草系统中表达及全细胞转化AD均为首次报道，且重组子表达的酶活及AD的转化率均较高。枯草芽孢杆菌 作为安全稳定的工业生产菌株，培养条件简单，发酵周期短，是微生物甾醇发酵工业潜在生产菌株。 

本发明通过单因子实验和正交实验，对该重组菌Bacillus subtilis168/pMA5-ksdD的发酵培养基组分、培养条件及全细胞转化工艺这三个方面进行了优化。最优培养基为麦芽糖35g/L，大豆蛋白胨∶酵母膏(2∶1)35g/L，氯化铵1g/L，氯化钾3.5g/L，玉米浆17.5g/L，pH7.0；最佳接种量为3％；最优培养条件为37℃，160r/min；最佳助溶剂甲基-B-环糊精，浓度是2g/L；底物AD浓度2g/L。优化后ADD产量达1.80g/L，较优化前的0.65g/L提高了177％。通过对该重组菌发酵策略的研究，使其全细胞转化AD产ADD的能力获得了较大幅度的提高，从而使其工业化进一步成为可能。 

发明内容

本发明的目的在于提供：一种使微生物全细胞转化AD产ADD能力大幅度提高的发酵策略。对构建的重组菌株Bacillus subtilis168/pMA5-ksdD进行了发酵策略的研究，优化后ADD产量提高了177％，得到了理想的结果。为微生物发酵生产ADD的工业化提供了有益的指导。 

本发明的技术方案：是通过单因子实验和正交实验，对构建的一株能全细胞转化AD生产ADD的重组枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis168/pMA5-ksdD的发酵培养基组分、培养条件及全细胞转化工艺进行了优化。本发明成功获得了一种使枯草芽孢杆菌工程菌株全细胞转化AD高产ADD的发酵优化策略，其ADD产量较优化前有较大提高。 

主要试剂：AD，ADD购自美国SIGMA公司 

重组菌株发酵策略的优化：