[发明专利]含有突变的lpdA基因的大肠杆菌及其应用

说明书

发明领域

本发明涉及通过遗传工程改造大肠杆菌的领域。具体而言，本发明提供了一种含有突变的lpdA基因的重组大肠杆菌。本发明还涉及使用所述大肠杆菌用于生产如乙醇、丁二酸、丁醇和1,3-丙二醇等化工原料的用途。本发明还提供了使用所述大肠杆菌生产乙醇和丁二酸等化工原料的方法，以及通过引入突变的lpdA基因而提高大肠杆菌中丙酮酸脱氢酶活性的方法。

发明背景

微生物发酵法生产化工原料(如乙醇、丁二酸等)近来取得了很大的进展。与传统的化学方法相比，微生物发酵法具有很多优势，例如高生产率、低成本、以及利用可再生的原料而非石油化工产品等。

在微生物发酵生产中，大肠杆菌(E.coli)由于其遗传背景清楚、易操作、易调控、易培养、生长迅速等优点，被广泛用于研究以获得高产菌株。大肠杆菌在缺氧条件下，通常消耗糖或其衍生物，并发酵产生甲酸、乙酸、乳酸、丁二酸、乙醇等产物。野生型大肠杆菌生产乙醇和丁二酸等的产率通常较低。近年来的研究表明，对大肠杆菌的代谢途径中所涉及的酶进行遗传改造，可以获得相应的高产菌株。

丙酮酸脱氢酶复合物(PDH)在大肠杆菌代谢途径中发挥重要的作用。丙酮酸脱氢酶是三个酶的复合物，催化丙酮酸不可逆氧化脱羧转化成乙酰辅酶A(acetyl-CoA)，同时将NAD⁺还原为NADH。乙酰辅酶A可继而被用于柠檬酸循环以进行细胞呼吸作用(cellular respiration)。丙酮酸脱氢酶复合物将糖酵解代谢途径与柠檬酸循环联系起来。丙酮酸脱羧也称作“丙酮酸脱氢反应”，因为其中也涉及了丙酮酸的氧化(Hansen et al.,1996Biochim Biophys Acta122:355–358;Bisswanger1981J Biol Chem256:815–822;Quail et al.,1994J Mol Microbiol12:95-104)。

在微生物厌氧发酵过程中，NAD和NADH是维持氧化还原反应的重要辅因子，其中NAD是重要的电子受体，而NADH则是电子传递过程中重要的辅因子，它决定着反应过程中还原力的供给(Garrigues et al.,1997J Bacteriol179:5282–5287;Cassey et al.,1998FEMS Microbiol Lett159:325-329)。在糖酵解过程中一分子葡萄糖产生两分子的NADH，而丙酮酸脱羧过程中，一分子葡萄糖可以产生两分子的乙酰辅酶A，并且伴随四分子的NADH产生(glucose→2acetyl-CoA→4NADH)，这相对于丙酮酸转化为甲酸的过程多产生了两分子的NADH，增加了还原力的供给，所以提高丙酮酸脱羧反应中丙酮酸脱氢酶(PDH)的活力，对提高代谢过程中的还原力供给有很重要的意义。

PDH作为连接糖酵解和三羧酸循环(TCA)的重要酶，其在好氧条件下酶活较高， 但在厌氧条件下酶活很低。PDH复合物所催化生成的产物乙酰辅酶A与NADH，能够抑制丙酮酸脱氢酶复合物的作用能力。NADH是用于微生物生物合成的重要的还原力来源，但是高浓度的NADH却会抑制丙酮酸脱氢酶复合物的活性，成为代谢路径中关键的限速酶。Kim(Kim et al.,2008J Bacteriol190:3851–3858)筛选得到了PDH复合体中的二氢硫辛酰胺脱氢酶(LPD)突变株E354K(lpd101)使PDH在无氧条件下对NADH抑制的敏感性显著下降,提高了利用该途径生产乙醇的能力。Zhou(Zhou et al.,2008Biotechnol Lett30:335-342)等的研究也表明，lpd突变的引入和对aceEF基因调控提高了丙酮酸脱氢酶(PDH)的活性，提高发酵过程中菌株的生长及产量。

为了提高大肠杆菌生产化工原料的产量和/或转化率，需要进一步对大肠杆菌的代谢途径进行改造。

发明概述

一方面，本发明提供了一种经工程化的重组大肠杆菌。