[发明专利]一种异戊二烯生产方法

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种异戊二烯的生产方法。

背景技术

异戊二烯（2-甲基-1,3-丁二烯）是一种高挥发性的共轭二烯烃，是合成橡胶的主要单体，其用量占异戊二烯总产量的95%，主要用于合成异戊橡胶，其产量仅次于丁苯橡胶和顺丁橡胶而居合成橡胶第三位，还可用于合成树脂、液体聚异戊二烯橡胶等。近年来，人们用异戊二烯合成里那醇、角鲨烯等，从而进一步合成香料、药品、农药等。异戊二烯还是天然产物萜类化合物的前体物质。

目前工业上有多种生产异戊二烯的方法，除C₅馏分分离得异戊二烯外，工业上还可采用合成法生产。由于各国原料价格和供应情况不同，不同国家采取的合成方法也有所不同，但更多的异戊二烯还是直接来自碳五馏分分离。由于现在采用的异戊二烯的生产方法主要是依赖于不可再生的化石燃料石油，尽管合成和分离技术不断成熟，但是原材料终将会成为制约异戊二烯产业发展的关键因素，此外生产中还存在着高能耗、高污染的问题。因此，采用生物学等清洁方法来生产异戊二烯就成为研究热点，但目前已有的生产方法还是存在生产效率低下等问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种异戊二烯生产方法，是将一种异戊二烯合成酶突变体基因转化入毕赤酵母中，构建得到能重组表达异源异戊二烯合成酶突变体的工程菌株，进而高效发酵生产异戊二烯。

本发明首先提供一种异戊二烯合成酶突变体，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1；其编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:2。

本发明另一个方面提供上述异戊二烯合成酶突变体的应用，即转化入毕赤酵母中来代谢生成更多的异戊二烯；具体就是将携带有异戊二烯合成酶突变体基因的重组表达载体转入毕赤酵母中。

本发明另一方面提供了一种生产异戊二烯的巴斯德毕赤酵母GSMISPS(Pichia pastoris GSMISPS)，其携带有能表达上述异戊二烯合成酶突变体基因的表达载体，该重组菌株已于2013年5月14日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO:M2013202。

本发明获得的异戊二烯合成酶突变体，相比于没有改造前的酶具有更好的活性。而且，本发明提供的异戊二烯生产方法简单、可靠、环保，构建得到的巴斯德毕赤酵母工程菌能高产异戊二烯，可广泛应用于异戊二烯的发酵生产，提高异戊二烯的产量。

附图说明

图1：本发明所用到的载体pPIC3.5-MIsps的遗传图谱；

图2：本发明代谢合成的异戊二烯检测的气相色谱图，其中A为含有野生型异戊二烯合成酶的毕赤酵母菌的顶空气体；B为毕赤酵母工程菌CCTCC NO：M2013202的顶空气体。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细描述。

本发明所用到的实验材料和试剂如下：

1、菌株与载体

大肠杆菌菌株DH5a，毕赤酵母，载体pPIC3.5，均购自Invitrogen公司。

2、酶与试剂盒

PCR酶，质粒提取，胶纯化，限制性内切酶、试剂盒等购自上海生工公司。

3、培养基

大肠杆菌培养基为LB(1％蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％NaCl，pH7.0)。LB-Amp为LB培养基加100ug/mL氨苄青霉素。

酵母培养基为YPD(1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖)；

酵母培养基BMGY(1％酵母提取物、2％蛋白胨、1.34％YNB、0.00004％Biotin、1％甘油(V/V))；

诱导培养基BMMY(1％酵母提取物、2％蛋白胨、1.34％YNB、0.00004％Biotin、0.5％甲醇(V/V))。

但对于上述的试剂或材料，本领域的技术人员可以根据其所实现的功能在市场上出售的产品中进行选择，而不仅限于本说明书实施例的具体记载。

实施例1异戊二烯合成酶突变体MIsps和pPIC3.5-MIsps表达载体的构建