[发明专利]蜡状芽孢杆菌及其在微生物转化制备L-草铵膦中的应用

说明书

（一）技术领域

本发明涉及一株新的产腈水解酶菌株——蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）ZJB-09280，及其在微生物转化制备L-草铵膦中的应用。

（二）背景技术

草铵膦为广谱、触杀型、灭生性、非残留除草剂，是世界第二大转基因作物耐受除草剂。草铵膦只有L-型具有植物毒性。目前，市场上销售的草铵膦一般都是外消旋混合物。如果草铵膦产品能以L-构型的纯光学异构体形式使用，可使草铵膦的使用量降低50%，这对于提高原子经济性、降低使用成本、减轻环境压力都具有十分重要的意义。

L-草铵膦可以采用不对称合成法和酶法合成来生产。酶法合成大体上可分为酶水解法、转氨酶法和酶拆分法。

（三）发明内容

本发明目的是提供一株可用于制备光学纯L-草铵膦的新菌种——蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）ZJB-09280，及其在微生物制备L-草铵膦中的应用。

本发明采用的技术方案是：

蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）ZJB-09280，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，邮政编码：430072，保藏日期2012年11月8日，保藏编号CCTCC NO：M2012450。

该新菌株的特征如下：

生理生化特征：阳性项目是：革兰氏阳性，糊精，D-麦芽糖，D-海藻糖，蔗糖，明胶，丙氨酸，精氨酸，L-谷氨酸，组氨酸，L-丝氨酸，果胶，D-半乳糖醛酸，肌苷，甘油，L-乳酸，L-苹果酸，醋酸，甲酸；全部阴性的项目是：柠檬酸，D-蜜二糖，D-棉子糖，D-乳糖，粘酸，D-山梨醇，D-阿拉伯糖醇，肌醇，对羟基苯乙酸，a-酮基丁酸，D-天冬氨酸。

本发明所涉及的微生物是通过以下的程序筛选得到的：

1）将由全国各地采回的土样和污水样接种到富集培养基中，在30℃，150rpm的摇床上培养3天，待培养基变混浊后，取1ml培养液转接到新鲜的富集培养基中，再培养3天。如此重复4～5个循环。富集培养基以1g/L（终浓度）2-氨基-4(羟基甲基磷酰基)-丁腈为唯一氮源，再加入其他物质配方如下（终浓度）：葡萄糖（5g/L），氯化钠（1g/L），K₂HPO₄·3H₂O(0.8g/L)，KH₂PO₄(3.3g/L)，MgSO₄·7H₂O(0.2g/L)，以自来水配制，pH为7。

2）最后一次富集培养液稀释后涂布到平板培养基上，挑取单菌落至斜面保藏。平板培养基为富集培养基中加入20g/L的琼脂。

3）挑取的单菌落接种到发酵培养基，组份如下（终浓度）：甘露醇（10g/L），酵母膏（3g/L），谷氨酸钠（10g/L），己内酰胺（7g/L），K₂HPO₄·3H₂O(0.75g/L)，KH₂PO₄(0.75g/L)，MgSO₄·7H₂O(0.5g/L)，以自来水配制，pH为7；25～45℃下，摇瓶转速100～300rpm，培养48h～72h，离心后悬浮于蒸馏水体系中。然后利用液相色谱法筛选产腈水解酶的菌株。

4）对通过上述方法筛选到的产腈水解酶菌株，通过水解转化反应进行复筛。按照上述方法培养得到的菌体，离心后悬浮于蒸馏水体系中，加入2-氨基-4(羟基甲基磷酰基)-丁腈作为底物，进行转化；用柱前手性衍生化反相液相色谱法分析产物的含量及光学纯度。

柱前手性衍生化反相色谱法的具体操作条件为：美国戴安U3000液相色谱仪（配置荧光检测器），变色龙色谱工作站；戴安C18色谱柱；流动性为50mmol.L^-1醋酸铵缓冲溶液（pH5.7）-甲醇（90:10）流动相，流速为1mL/min；进样量20μL，柱温35℃，激发波长350nm，发射波长450nm。