[发明专利]用于p21靶基因相关miRNA的回收和鉴定的探针、试剂盒和方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术和医学领域。具体而言，本发明涉及靶基因相关miRNA回收、鉴定技术的实施方法及应用，尤其是在动物细胞系中的应用，例如在人肿瘤细胞株中的实施方法和用途。

背景技术

MicroRNA(miRNA)是长约20～24nt、非编码的微小RNA，它们通过抑制mRNA翻译或者促进mRNA降解对靶基因进行转录后水平的调控(Bartel，D.P.，Cell.2004，116：281-297)。MiRNA是一种调控细胞功能作用非常广泛的非编码小RNA，几乎控制着每一个生物学过程，包括细胞的分化、发育、增殖和凋亡。此外，现在研究表明miRNA表达水平失调与很多疾病包括肿瘤、自身免疫性疾病、糖尿病、心脏病等疾病密切相关(Hobert，Trends Biochem.Sci.2004，29：462；Lu，J.等，Nature.2005，435：834-838；Li，Q.J.等，Cell.2007，129：147-161；Cheng，H.Y.等，Neuron.2007，54：813-829；Chang，T.C.等，Mol Cell.2007，26：745-752；He，L.等，Nature.2005，435：828-833；Care，A.等，NatMed.2007，13：613-618)。

MiRNA的生物学功能是人们非常关注的问题，而miRNA靶基因的确定是研究miRNA生物学功能的关键，目前有关miRNA靶基因的确定主要靠计算机生物信息学软件预测和生物学实验方法(Daniel，W.T.等，Nucleic Acids Res.2011，39：6845-53；U.A.等，Gene.2009，451：1-5)。

目前，常用的计算机生物信息学预测软件有miRanda、PicTar、TargetScan、PITA和RNA22。生物信息学方法主要是利用某种算法对靶基因样本进行评分及筛选，因为人们在研究过程中发现，miRNA和靶基因间的作用具有一定规律性。因此，目前的预测方法虽然各不相同，但主要遵循以下几个常用原则(Krek，A.等，Nat Genet.2005，37：495-500；Lall，S.等，Curr Biol.2006，16：460-71；Lewis，B.P.等，Cell.2005，120：15-20；Kiriakidou，M.等，Genes Dev.2004，18：1165-78；Kertesz，M.等，Nat Genet.2007，39：1278-84；Miranda，K.C.等，Cell.2006，126：1203-17)：

(1)miRNA与其靶位点的互补性；

(2)miRNA靶位点在不同物种之间的保守性；

(3)miRNA-mRNA双链之间的热稳定性；

(4)miRNA靶位点处不应有复杂二级结构；

(5)miRNA的5′端与靶基因的结合能力强于3′端。

然而，使用计算机预测动物中miRNA靶基因是一件十分困难的事情，这主要是因为动物细胞中miRNA和其靶基因采取非完全互补的模式。目前已知的miRNA靶基因及其确切的靶点并不多，在算法编写过程中没有足够的已知样本可参考，即使不断增加和改进限制条件，也难以获得同时具有高特异性和高灵敏度的算法。并且，目前对计算机预测出来的靶基因也没有一个快速的高通量鉴定方法，这也在很大程度上影响了对算法准确性的评估，因而无法对其进行优化。

由于计算机模拟在预测miRNA靶基因时存在一定的局限性，很多学者希望能够利用生物学实验方法直接寻找miRNA靶基因。生物学实验方法寻找miRNA靶基因主要有以下几种方式：

(1)从mRNA水平寻找miRNA靶基因(Lim，L.P.等，Nature.2005，433：769-773)，通过miRNA影响mRNA的稳定性来寻找miRNA的靶基因。但是，该方法存在不能区分是直接靶基因还是间接靶基因的缺点。同时，这种方法在寻找起翻译抑制作用的miRNA靶基因时存在困难；