[发明专利]草莓双向电泳差异蛋白质图谱的获取方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种草莓双向电泳差异蛋白质图谱的获取方法。

背景技术

草莓是一种重要的经济作物，利用基于双向电泳的蛋白质组学技术， 可以快速挖掘草莓在应答病菌侵染过程中所产生的差异基因表达产物 ，从而阐述抗病机制，为将来草莓抗病育种工作提供重要技术支撑。

现有研究草莓抗病机理的方法往往借助于基因组学技术，可以在一定 程度上挖掘植物应答胁迫的重要基因。但是因为蛋白质是基因表达的 最终产物，所以找出与抗病相关的直接差异蛋白将更有助于抗病机理 的研究。利用基于双向电泳的差异蛋白质组学技术，获得高质量的差 异蛋白蛋白图谱，是研究抗病机理的强有力工具。

目前利用双向电泳获得蛋白图谱的方法在生物医学领域和部分植物研 究（如苹果叶片）等植物种类有一定程度的应用，但是在草莓研究方 面几乎空白。张彩霞等借助酚抽提法在苹果叶片中得到了高质量的蛋 白质点图谱，但该方法并不适用于草莓。 

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种能得到高质量双向电泳差异蛋白 质图谱的草莓双向电泳差异蛋白质图谱的获取方法。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种草莓双向电泳差异蛋白质图 谱的获取方法，包括以下步骤：

1）、蛋白质的提取；

2）、第一向IPG等电聚焦(IEF)电泳；

3）、胶条的平衡；

4）、胶条的转移及SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳；

5）、凝胶扫描和图像分析。

作为本发明的草莓双向电泳差异蛋白质图谱的获取方法的改进：

步骤1）为包括以下步骤：

①、取1 g草莓叶片加入液氮，研磨后悬浮于14~16ml（较佳为15ml） 的三氯乙酸-丙酮溶液中，于-18~-22℃（较佳-20℃ ）沉淀10~14小 时（较佳为12小时）；

所述三氯乙酸-丙酮溶液中三氯乙酸的体积浓度为10％；

②、将步骤①的所得物离心，弃上清；

③、步骤②所得沉淀悬浮于14~16ml（较佳为15ml）的B-巯基乙醇冷丙 酮溶液；离心，将所得的沉淀重复上述悬浮和离心2~5次；

所述B-巯基乙醇冷丙酮溶液的制备方法为：将冷丙酮与B-巯基乙醇按 照1：0．07％的体积比进行混合；所述冷丙酮为温度为3~5℃（较佳为 4℃）的丙酮；

④、将步骤③所得的沉淀干燥处理（例如为真空抽干45分钟），得到 粗蛋白干粉；

加入0.9~1.1ml（较佳为lml）裂解液A以溶解上述粗蛋白干粉，离心， 所得上清为蛋白提取液，可于-20℃ 保存；

所述裂解液A为在每ml水中加入420mg尿素、 150mg硫脲、40mg 3-[ 3-(胆酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐、7.2mg二硫苏糖醇、12μL载体 两性电解质（载体两性电解质Ampholine pH3-10，40%）、5μL苯甲 基磺酰氟混合后而得。

作为本发明的草莓双向电泳差异蛋白质图谱的获取方法的进一步改进 ：

步骤2）的第一向IPG等电聚焦(IEF)电泳为：

将50μL步骤1）所得的蛋白提取液、250μL  IPG buffer混匀配成 水化溶液，装入17cm等电聚焦槽中；取17cm的pH3-10的等电聚焦胶条 （美国伯乐公司生产）一根（揭掉封膜后用）放入等电聚焦槽中，从 而使等电聚焦胶条在水化溶液中均匀浸湿；再滴矿物油至等电聚焦槽 的槽深1/2处，从而盖住整个等电聚焦胶条，盖上等电聚焦槽的槽盖后 进行等电聚焦；等电聚焦操作严格按照仪器使用说明书进行；IEF设定 参数如下：

上述IPG buffer的制备方法为：在每ml水中加入480mg尿素、20mg  3-[3-(胆酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐、7.5mg二硫苏糖醇、12μL 载体两性电解质（载体两性电解质Ampholine pH3-10，40%）混合后 而得。

作为本发明的草莓双向电泳差异蛋白质图谱的获取方法的进一步改进 ：

步骤3）的胶条的平衡包括以下步骤：

①、配制平衡缓冲液：

在1L的Tris-Hcl缓冲液（0.35mol/L ，pH 8.8）中加入6mol的尿素 ，200ml的甘油，20g的十二烷基硫酸钠(SDS)；得平衡缓冲液；