[发明专利]一种构建降解组测序文库的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体涉及一种构建降解组测序文库的方法

背景技术

miRNA（microRNA）是一类长度约为22核苷酸的内源性非编码RNA，几乎参与了动植物体内所有重要的生命活动，调控相关基因的表达。通常，miRNA通过与靶基因（mRNA）部分或完全配对，引起基因的翻译抑制或是基因的内切酶剪切来实现对基因的表达调控，在动物体内以基因的翻译抑制居多，在植物体内则以靶基因被剪切占多数。利用成熟的miRNA微阵列芯片或是qPCR技术可以高效快速地筛选出动植物体内差异表达的miRNA，而找出差异miRNA作用的靶基因成为研究其重要生物学功能的关键。

不同于动物，植物miRNA通常与靶基因进行完全或接近完全的配对引起靶基因的剪切从而调控基因的表达。最初科研人员利用这一特征对植物miRNA的靶基因展开了生物信息学预测，并获得了许多有意义的研究成果。然而，由于预测方法无法区分预测靶基因的真伪，所有预测结果必须经实验证实以去伪存真。这极大地影响了靶基因的探索效率。同时在一些情况下，如miRNA与靶基因间存在较高错配时，预测方法可能会丢失许多真实的靶基因。

伴随下一代测序（Next Generation Sequencing）或称高通量测序（High-throughput Sequencing）的出现和发展，近来出现了一种新的实验方法称为降解组测序（Degradome Sequencing），它结合了高通量测序技术与生物信息学分析各自的优势，已成功应用于拟南芥1,2，水稻3等植物的miRNA靶基因筛选。降解组测序的原理是，在植物体内绝大多数的miRNA是利用剪切作用调控靶基因的表达，且剪切常发生在miRNA与mRNA互补区域的第十位核苷酸上。靶基因经剪切产生二个片段，5’剪切片段和3’剪切片段。其中3’剪切片段，包含有自由的5’单磷酸和3’polyA尾巴，可被RNA连接酶，连接产物可用于下游高通量测序；而含有5’帽子结构的完整基因，含有帽子结构的5’剪切片段或是其他缺少5’单磷酸基团的RNA是无法被RNA酶连接，因而无法进入下游的测序实验；对测序数据进行深入地比对分析，可以直观地发现在mRNA序列的某个位点会出现一个波峰，而该处正是候选的miRNA剪切位点。利用降解组测序，科研人员摆脱了生物信息学预测的限制，真正从实验中找到了miRNA的作用靶基因。

发明内容

本发明目的在于提供了一种降解组测序文库的构建方法，该方法能准确找到动植物miRNA作用于靶基因的具体位点，操作简单方便且结果直观。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案为：一种构建降解组测序文库的方法,包括以下步骤：

1）.miRNA靶基因mRNA片段的分选：将3’接头（3’Adapter序列：5’-TGGAA TTCTC GGGTG CCAAG G-3’）与靶基因mRNA片段的3’端退火互补，其反应条件是：

将上述连接混合物于65℃保温3分钟，获得含有3’接头—mRNA连接产物的连接混合物；

2）.根据权利1所述连接产物的反转录：将步骤1所获的连接混合物中的3’接头—mRNA连接产物连上5’接头（5’Adapter序列：5’-GUUCA GAGUU CUACA GUCCG ACGAU C-3’），反转录获得两端均带有接头的靶基因mRNA片段，其步骤是：

a）.mRNA的5’接头连接:

将上述反应体系于37℃保温1-2小时，之后置于冰上；

b）.纯化:

往反应体系中加入75μl H₂O无水乙醇，-80℃放置30分钟，16000g离心30分钟，去上清后冷冻干燥，加入19μl RNase Free H₂O；获得纯化的连接产物；

c）.反转录:

将上述混合物于25℃静置2分钟,加入1μl反转录酶,于25℃保温10分钟，再于42℃保温40分钟，最后于70℃保温20分钟；