[发明专利]一种快捷高通量的体外DNA序列修改方法

说明书

技术领域

本发明涉及到分子生物学领域，具体涉及体外DNA的修改方法。

背景技术

目前在分子生物学上DNA的点突变主要是用PCR法实现，即设计一条左侧和一条右侧的扩增引物和一个长链的突变引物，经过两次独立的PCR反应，分别得到两个包含突变点的两端DNA然后在将此两段DNA同时加到一个反应体系中作为模板，用两个侧翼引物再进行一轮PCR扩增得到全长的修改后的DNA片段。另一种方法是通过设计突变引物反扩片段和整个载体，然后通过DpnI消化模板质粒，这些方法操作过程较为复杂，而且每次只能突变一个位点，这是目前所有点突变技术共同存在的问题：通量低，一次只能突变一个点如果要进行多个点的突变就要用多轮实验来实现，费时、费力，效率低。

发明内容

本发明的目的在于，针对上述不足提供一种体外DNA序列修改方法。

本发明一种体外DNA序列修改方法，该方法通过设计合成针对修改位置的突变引物，该突变引物的一端具有识别位点和酶切位点不重合的限制性内切酶识别序列，用待修改的目标DNA做模板，PCR扩增并酶切，连接。

针对目标DNA不同的待修改位置，可设计合成多个针对不同修改位置的突变引物，这些突变引物的一端具有typeIIS酶识别序列，用待修改的目标DNA做模板，先进行PCR扩增，然后通过酶切—连接，将突变点引入。

上述突变引物包括：保护碱基、酶切识别位点、酶切位点、模板识别序列、DNA编辑位点，DNA编辑位点位于粘末端内或者模板识别序列与粘末端之间。

具体地，引物序列的结构如图1所示。保护碱基是任意添加的为了保证限制性内切酶能够切割DNA分子（一般长度1-5个碱基）；酶切识别位点是限制性内切酶的识别位点，例如是BbsI其酶切位点是：GAAGAC(2/6)；粘末端位点为酶切粘末端产生位点；扩增模板识别位点是PCR扩增中与模板退火的位点；DNA编辑位点：为按照意图进行DNA突变的位点，突变指导位点可以在粘末端位点内或者模板识别位点内。 用待突变的目标DNA做模板，对于不同的突变点，用突变引物分段扩增。并用PCR回收试剂盒或者胶回收试剂盒纯化扩增产物。将回收产物的所有DNA片段和载体一起进行酶切连接反应。将连接产物进行转化感受态细胞。挑取阳性克隆进行测序鉴定。这样就能筛选到阳性克隆。

本发明方法与常规PCR点突变法相比更为高效，快捷简单的DNA序列修改方法，此方法不仅适用于DNA的点突变，更适合于更大DNA片段的插入，缺失，修改。实现本方法的策略主要使用到不对称限制性内切酶进行酶切连接来实现，该方法简捷，高效，每次可以对DNA上的多个位点同时进行突变。

附图说明

图1是设计的突变引物的结构示意图，[N]X，X为下标，=0,1,2...;N为任意碱基。

图2是实施例1中的DNA序列A。

图3是实施例1中的DNA序列B。

图4是mut1-7：7个片段的扩增结果；D2000：DNA marker（2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp）

图5是PCR鉴定转化结果，Marker: D2000(2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)。目标片段大小约1600bp，阳性率约75%。

图6是测序比对结果。A为序列A，B为序列A突变后的预期序列,1,2,3,4,5,6为突变后的的6个克隆测序结果。a，b，c，d，e，f为突变的6个点，表明6克隆中，每个克隆中的6个突变点全部按照预期实现突变。

图7是DNA测序峰值图。a，b，c，d，e，f为突变的6个各自峰值图。e，f为反向测序结果，峰值图部分显示的为互补序列。

具体实施方式

以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。

实施例一：

将DNA序列A，突变成DNA序列B。一次进行6个位点的突变，包含有碱基增加，缺失，替换，颠换的突变方式。

序列A为载体pCAMBIA1301的载体（购自Cambia）上部分序列，为GUS基因，可见cambia网站（www.cambia.org）。

第一步：根据突变内容设计如下突变引物：7对突变引物扩增7个片段，7个片段之间的6连接位点分别对应6个突变位点。