[发明专利]一种连续微波辅助蛋白酶解的方法

说明书

技术领域

本发明属于微波辅助酶催化反应技术领域，特别涉及一种连续微波辅助蛋白酶解的方法。

背景技术

将大分子蛋白质分解成多肽是蛋白质研究的一项重要内容。通过对植物及动物蛋白的酶解，可开发出一系列具有广阔应用前景的活性多肽，如抗高血压肽、抗菌肽、免疫调节肽、细胞调节肽、抗血栓肽、抗氧化肽以及抑制胆固醇作用肽等；传统酶解方法存在酶解时间长，酶解条件不易控制，酶解产物、酶及底物难以分离等问题；微波辅助蛋白酶解技术是近年来发展起来的快速蛋白酶解技术，其原理是利用微波频率的共振使蛋白质大分子类似于偶极子分子在微波的作用下产生振荡，这种振荡使蛋白质分子在微波的触发下产生相干、有序的振动，从而加速蛋白质的酶解；同时，微波具有可以直接穿透样品的特性，在短时间内将蛋白质水解成多肽或氨基酸，使酶解反应能够快速高效的进行；因此，近年来微波辅助酶解技术在酶解蛋白质方面得到了广泛应用；由于高温常致蛋白酶变性失活，因此微波辅助蛋白酶解技术中的关键是控制微波作用的热效应导致的温度急剧上升现象；现有的微波辅助酶解技术主要是通过迅速降低酶解过程中的微波辐射功率或者采用间歇微波作用等方式来实现反应温度的控制；采用这些微波辅助酶解方式，酶解过程会因微波作用功率不恒定而变得不稳定，从而影响酶解过程的控制和酶解的效率，同时也无法深入了解微波辅助作用过程中蛋白酶与蛋白的作用机制。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种连续微波辅助蛋白酶解的方法，该方法借助一种连续微波辅助蛋白酶解装置，既能保证足够强的微波辐射强度，控制酶解温度，又能保证微波作用的连续性，提高酶解效率。

本发明的思路：借助一种连续微波辅助蛋白酶解装置实现本发明的方法，该装置是在传统微波装置的基础上加入外部冷却循环系统，保证酶解过程在既定温度，连续且稳定的微波作用下进行。

具体步骤为：

(1)设置一种连续微波辅助蛋白酶解装置，包括微波合成仪和低温循环泵，微波合成仪为可调型微波发射源，微波合成仪的微波屏蔽腔底部设有磁力搅拌装置，用于控制酶解过程中的磁力搅拌，在微波合成仪的微波屏蔽腔内设置装有冷却液的玻璃冷却腔，玻璃冷却腔内设有玻璃酶解腔，玻璃酶解腔中心接有红外探温头用于监测酶解反应温度，玻璃酶解腔外绕蛇形玻璃冷凝管，蛇形玻璃冷凝管也置于玻璃冷却腔内；低温循环泵从微波合成仪外部经过管道连接蛇形玻璃冷凝管，冷却液通过低温循环泵泵入蛇形玻璃冷凝管中，通过调节冷却液的温度和流速控制酶解反应温度。

(2)取待酶解蛋白和酶置于步骤(1)所述装置的玻璃酶解腔内，按照蛋白酶解条件，设定步骤(1)所述装置的微波发射功率、磁力搅拌速度、微波加热上限温度和微波酶解时间，所述微波加热上限温度设置为比实际酶解温度高5℃；再通过控制冷却液温度和冷却液流速，使反应体系因微波作用产生的热量与冷却系统消耗的热量保持平衡，反应体系温度保持稳定，从而使蛋白酶解过程中微波功率保持连续和恒定，达到连续微波辅助蛋白酶解的目的。

所述冷却液为正己烷、正庚烷和正辛烷中的一种。

相对于现有的微波辅助蛋白酶解技术，本发明方法的优点在于酶解过程中在维持酶解温度稳定不变的前提下可实现微波的连续辐射及功率恒定，从而提高酶解效率及酶解过程的可控性。

附图说明

图1为本发明所使用装置的连接结构示意图。

图中标记：1-低温循环泵；2-红外探温头；3-微波合成仪；4-蛇形玻璃冷凝管；5-玻璃冷却腔；6-玻璃酶解腔。

图2为本发明实施例中100 瓦连续微波功率固定化胰蛋白酶酶解牛血清蛋白所得产物的LC-MS图。 

具体实施方式

实施例：

本实施例以氨基化修饰的磁性微球固定化胰蛋白酶酶解牛血清蛋白为例，具体步骤为：

(1)设置一种连续微波辅助蛋白酶解装置，包括微波合成仪3和低温循环泵1，微波合成仪3为可调型微波发射源，微波合成仪3的微波屏蔽腔底部设有磁力搅拌装置，用于控制酶解过程中的磁力搅拌，在微波合成仪3的微波屏蔽腔体内设置装有冷却液的玻璃冷却腔5，玻璃冷却腔5内设有玻璃酶解腔6，玻璃酶解腔6中心接有红外探温头2用于监测酶解反应温度，玻璃酶解腔6外绕蛇形玻璃冷凝管4，蛇形玻璃冷凝管4也置于玻璃冷却腔5内；低温循环泵1从微波合成仪3外部经过管道连接蛇形玻璃冷凝管4，冷却液通过低温循环泵1泵入蛇形玻璃冷凝管4中，通过调节冷却液的温度和流速控制酶解反应温度。

所述冷却液为正己烷。

(2)取70 毫克的氨基化修饰的磁性微球固定化胰蛋白酶置于步骤(1)所述装置的玻璃酶解腔6内，加入2 毫升1毫克/毫升的牛血清蛋白溶液(pH=8.00, 0.05摩尔/升的 tris-HCl缓冲液为溶剂)，按照蛋白酶解条件，设定步骤(1)所述装置的微波发射功率为100瓦，磁力搅拌速度为500转/分钟，微波加热上限温度为60℃（实际所需酶解温度为55℃，微波加热上限温度比实际酶解温度高5℃），微波酶解时间为10分钟；再控制冷却液温度为20℃，冷却液流速为8 升/分钟，使反应体系因微波作用产生的热量与冷却系统消耗的热量保持平衡，反应体系温度保持稳定，从而使牛血清蛋白酶解过程中微波功率保持连续和恒定，达到氨基化修饰的磁性微球固定化胰蛋白酶连续微波辅助牛血清蛋白酶解的目的。