[发明专利]白血病融合基因的检测方法及其引物、探针和基因芯片

说明书

本发明公开了一种多重RT‑PCR联合基因芯片检测白血病融合基因的方法，步骤包括：1）抽提样本细胞总RNA；2）RNA特异性逆转录为cDNA；3）多重RT‑PCR扩增cDNA；4）用含检测白血病融合基因的特异性探针的基因芯片检测PCR扩增产物。本发明还公开了上述方法所用的探针、引物和基因芯片。本发明采用一管巢式多重PCR，扩增样本中可能含有的特异性融合基因片段，再通过基因芯片杂交和芯片扫描图像分析，获得融合基因检测结果，如此实现了15个白血病融合基因的27种及以上不同融合形式的特异性片段的同时检测，从而大大提高了白血病融合基因的检测效率，有利于大规模的临床筛选。

技术领域

本发明涉及基因检测技术领域，特别是涉及一种多重RT-PCR联合基因芯片检测白血病融合基因的方法，以及该方法所用的特异性探针、引物和基因芯片。

背景技术

白血病是造血系统的一种恶性肿瘤，年发病率约为2.76人/10万人，占癌总发病数的5%，儿童及35岁以下成人恶性肿瘤死亡率排名第一位。白血病的发生发展是一个复杂的过程，往往涉及多个基因的改变，包括正常基因的突变或缺失、癌基因的异常扩增和表达以及多个基因的协同作用，加之基因本身多效性和免疫因素，最终决定肿瘤表型是否表达。

根据病程、临床表现白血病可分为两大类急性白血病和慢性白血病。根据母细胞来源又可将急性白血病分为急性淋巴性白血病（Acute Lymphoblastic Leukemia，ALL），急性髓性白血病（Acute Myelogenous Leukemia，AML）；慢性白血病分为慢性淋巴性白血病（Chronic Lymphocytic Leukemia，CLL），慢性髓性白血病（Chronic MyelogenousLeukemia，CML）。其中以急性白血病多见（70％），各年龄均可发生，而且男性多于女性。成年人中最常见的是AML和CML，儿童中比较常见的是ALL。

部分白血病的发生可能与染色体易位所形成的融合基因有关，如染色体易位t(9;22)(q34;q11)BCR-ABL p190、t(4;11)(q21;q23)MLL-AF4、t(12;21)(p13;q22)TEL-AML1、t(1;19)(q23;p13)E2A-PBX1可能会与ALL相关；t(8;21)(q22;q22)AML1-ETO、inv(16)(p13;q22)/t(16;16)(p13;q22)CBFB-MYH11、t(15;17)(q22;q12)PML-RARA、t(9;11)(p22;q23)MLL-AF9及其他一些11q23MLL基因重排可能会与AML相关。染色体异位形成的融合基因的检测，结合临床细胞形态学检查、骨髓象检查等，可进行白血病的诊断、预后和治疗方面的分析。

检测白血病染色体异常的方法主要有常规G显带染色体核型分析、荧光原位杂交技术（Fluorescence in situ hybridization，FISH）和PCR技术。常规G显带染色体核型分析依旧是染色体遗传病检查的重要手段，它能够可靠识别染色体数目和结构的变化，尽管在灵敏度和操作性上有局限，比如白血病细胞分裂指数低、染色体形态短小、常显带不清、隐匿型易位，使得一些结构复杂或细微的改变难以准确识别。FISH是利用荧光标记探针结合特定染色体序列，从而得以在显微镜下分析。通过探针荧光可以识别显微甚至亚显微的隐匿型结构异常和染色体数目变化。FISH相对于核型分析更能直接观察染色体异常，而且灵敏度更高，适用于分裂间期中期细胞，但其仅能对已知探针的基因位点进行分析。PCR检测急性白血病相当普遍，不仅对白血病的诊断有用，而且更适用于对白血病微小残留病灶的检测。这些方法都具有各自的优缺点，但是都不适合于多样本的白血病融合基因筛查。