[发明专利]适应无血清培养的重组蛋白高表达细胞株QB-TN9-4S-CL-F及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及无血清培养的昆虫细胞系，尤其涉及粉纹夜蛾细胞克隆株QB-TN9-4S-CL-F（简称QB-Tn9-CL-F）的无血清培养。本发明还涉及无血清条件下该细胞克隆在制备病毒杀虫剂和重组蛋白生产中的用途，属于细胞生物学和生物技术领域。

背景技术

自世界上第一个昆虫细胞系建立以来（Grace1962），昆虫细胞培养已广泛的应用于生物学基础研究和生产领域。利用杆状病毒对昆虫细胞的感染，大量复制病毒作为生物杀虫剂，其产品与活虫体生产的产品比较具有很多优点（Wise and uaughn,1986；Granados efal.1987)。特别是杆状病毒--昆虫细胞表达载体系统的建立，可通过病毒感染昆虫细胞，大量表达病毒携带的外源基因，生产重组蛋白(Luckow and Summers,1988）。由于这一系统具有高效、安全、容量大、表达的产物具有生物活性等优点，所以昆虫的细胞培养无论在病毒杀虫剂的生产还是在生物学、医学及农业领域中的外源基因产物表达方面都是引人注目的很有发展潜力的载体（Ping Wang.efal.1992）。

目前人们已利用几种昆虫细胞系成功表达和生产多种昆虫病毒杀虫剂、疫苗和医学产品（Granados1994；Altman etal.1999）(Granados efal.2007)。通常昆虫培养基含10%的胎牛血清（FBS），以提供细胞生长的必要营养。由于胎牛血清价格昂贵而限制了病毒杀虫剂的离体大量生产；在生产重组蛋白过程中，培养基中血清的存在，也使表达的产物纯化和回收造成很大的困难，另一方面，在病毒复制阶段，低血清或无血清的培养基有助于提高重组蛋白的表达水平或多角体蛋白生产。开发稳定适应无血清培养的细胞株就成为降低成本提高产量的技术关键。为此，开发无血清培养基及细胞的无血清培养一直是昆虫细胞培养工程领域的研究热点。但这方面的报道甚少，在80年代报道Sf9（Spodoptera frug；perda）细胞株无血清培养的生长特性(Maiorala et.al.1988;Inlow et.al.1989)，最近有报道BTI-Tn5B1-4和HzAm1（棉铃虫的细胞系）细胞的无血清或低血清驯化（Granados et.al.1995戴虎等，2000；张佑红等，2005）。

在这些研究中尚无报道在无血清培养昆虫细胞长期传代后病毒的产量和外源基因产物表达。本发明人成功地驯化了一株新的细胞克隆QB-TN9-4S-CL-F。该克隆株在无血清培养中长期传代(P.50)后表现了稳定高产高表达的良好特性。

发明内容

本发明要解决的技术问题是驯化出一株在无血清培养条件下保持旺盛的生命力，具有病毒高产，重组蛋白高表达的细胞。

本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：

本发明的一株无血清培养的粉纹夜蛾细胞克隆株，命名为QB-TN9-4S-CL-F，简称QB-Tn9-CL-F，其微生物保藏号是：CCTCC NO：C201327；分类命名是：粉纹夜蛾细胞系；保存时间是2013年4月9日；保存单位是：中国典型培养物保藏中心；保存地址是：武汉大学。

稳定适应无血清培养的细胞可克服昂贵血清造成的生产成本高，表达产物不易纯化，表达水平低等细胞培养工程领域中的难题。为此本发明利用多种无血清培养基（TC-100，Grace‘s，Sf900Ⅲ）在不同的细胞株中测试筛选，经多次递减血清重复培养、筛选，最终获得可在Sf900ⅢSFM（简称Sf900III）培养基中长期稳定培养的细胞株。本发明所获的适应无血清培养的细胞株在Sf900Ⅲ培养基中连续传代50次以上生长良好，特征稳定，与在含10%血清培养基中培养时无明显差别。在表达水平上，无血清培养的QB-Tn9-CL-F克隆株重组蛋白表达水平比在完全培养基中培养时明显提高，由于无胎牛血清也避免了基因工程表达产物的纯化和后处理的难题。因此在外源基因活性蛋白工业化生产方面展示了广阔的前景。

此外，本发明还提出了所述的适应无血清培养的粉纹夜蛾细胞克隆株在制备杀虫病毒或重组蛋白中的用途。

在用于制备杀虫病毒时，可直接利用杀虫病毒感染所述的细胞克隆株，进行无血清悬浮培养，进行杀虫病毒的大量生产。

所述的杀虫病毒包括能感染该细胞所有昆虫病毒，优选的，所述的杀虫病毒为可作为生物杀虫剂的苜蓿夜蛾核型多角体病毒（AcMNPV）或其它种类的杀虫病毒。

本发明的无血清培养的细胞克隆株对AcMNPV高度敏感，产量可与在血清培养的相似，为大规模低成本生产病毒杀虫剂提供了良好的途径。