[发明专利]一种卡那霉素A酶联适配体检测方法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及食品安全检测领域，具体地，涉及一种卡那霉素A酶联适配体检测方法及其应用。 

背景技术

卡那霉素A（Kanamycin A, KaA）是一种氨基糖苷类抗生素药物，具有广谱抗菌性，对革兰阴性菌和革兰阳性菌都有效，可促进家畜的生长，因此广泛用于农业、畜牧业、水产业。但是，卡那霉素A具有严重的肾毒性、耳毒性、神经肌肉接头的阻滞作用以及过敏反应，在畜、禽、水产品中的残留危害问题日益引起人们关注。因此多个国家和地区都规定了其最大残留限量，欧盟明确规定禁止使用氨基糖苷类抗生素作为家畜的生长促进剂，我国国标方法《奶粉和牛奶中链霉素、双氢链霉素和卡那霉素残留量的测定液相色谱-串联质谱法》（GB/T 22969-2008）中规定卡那霉素的检出限为10 μg/kg。 

目前国内外对食品中卡那霉素A的常用检测方法有液相色谱法（HPLC）、液相色谱-质谱联用（HPLC-MS）、免疫测定法等。仪器法样品前处理繁琐，操作复杂，仪器昂贵，不能满足快速筛选检测的要求。免疫分析法灵敏、特异，简单快速，但小分子半抗原的抗体制备非常复杂，研发周期太长。因此，人们一直都在不断寻找新的生物识别分子，以实现对卡那霉素A进行快速、高效的检测和监测。 

核酸适配体（aptamer）是近年来发展起来的一类单链寡核苷酸，能高效、特异地结合各种目标物质，不但具备抗体类似的特异性，而且无免疫原性和毒性，无需动物免疫，还可经体外合成，成为近年生物分析的一种新方法，在食品安全检测中预计会发挥越来越重要的作用。然而，有关卡那霉素A快速筛选检测方法（surveillance screening method）的研究主要集中在免疫检测，如《用于检测卡那霉素残留的免疫胶体金试纸条及其制备方法》（申请号：200810116854.0）公开了一种胶体金免疫层析试纸方法；《卡那霉素残留酶联免疫分析试剂盒及其应用》（申请号：200710064345.3）公开了一种酶免疫检测方法，使用方便性和方法灵敏度都有一定不足。目前尚未见到卡那霉素A酶联适配体的检测方法的研究报道。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术对于卡那霉素A检测技术在使用方便性和灵敏度方面的不足，提供一种卡那霉素A酶联适配体检测方法。该方法是一种快速、简便、特异性和灵敏度良好的检测实际样品中卡那霉素A的方法，填补尚未有卡那霉素A酶联适配体检测技术的空白。该方法的最低检测限达到（IC₁₀）0.04 ng/mL，检测范围（IC₂₀~IC₈₀）为0.07~71.5 ng/mL，半抑制率（IC₅₀）为2.2 ng/mL，能够特异性检测牛奶、猪肉、鸡肉、猪肝、蜂蜜中的卡那霉素A。 

本发明的另一个目的是提供一种卡那霉素A酶联适配体检测方法以检测食品中卡那霉素A的应用。 

本发明通过以下技术方案予以实现上述目的： 

    一种卡那霉素A酶联适配体检测方法，包括如下步骤：

S1.用碳酸盐缓冲液稀释链霉亲和素得1~64 μg/mL的包被缓冲液，将包被缓冲液加入微孔板中，每孔100~200 μL，包被过夜，洗涤微孔板后，加入封闭缓冲液封闭，最后烘干；

S2.用PBS缓冲液稀释5’端修饰有生物素的卡那霉素A的ssDNA 适配体得浓度为0.5~8 nmol/L的适配体溶液，将适配体溶液加入步骤S1的微孔板中，每孔100~200 μL，孵育，洗板后拍干；使适配体和包被在微孔板上的链霉亲和素连接固定得到固相适配体；

S3.用辣根过氧化物酶标记卡那霉素A 分子形成标记竞争物KaA-HRP；

S4.将待测样品和KaA-HRP同时加入步骤S2制备得到的固相适配体中，标记竞争物KaA-HRP与待测样品中的卡那霉素A分子竞争结合固相适配体，即可实现卡那霉素A的酶联适配体检测；

所述卡那霉素A的ssDNA 适配体的序列如SEQ ID NO：1所示。

    优选地，所述卡那霉素A酶联适配体检测方法包括如下步骤： 

S1.用碳酸盐缓冲液稀释链霉亲和素得1~64 μg/mL的包被缓冲液，将包被缓冲液加入微孔板中，每孔100~200 μL，包被过夜，用磷酸盐缓冲液洗涤微孔板后，再加入0.1~0.3%酪蛋白封闭，最后烘干；