[发明专利]一种高纯度非达霉素的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及抗生素的分离纯化方法，具体地说是从非达霉素发酵菌丝体中分离纯化非达霉素的方法。 

背景技术

非达霉素（Fidaxomicin）是通过指孢囊菌发酵产生的一种18 元环结构的新型大环内酯类抗生素，分子式C₅₂H₇₄Cl₂O₁₈，结构式如下： 

非达霉素结构式

非达霉素属于窄谱型抗菌药物，主要抗革兰阳性需氧及厌氧菌、艰难梭菌，对耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌、产气夹膜梭菌和肠球菌有良好的抗菌作用，而对革兰阴性菌抗菌活性极弱。非达霉素对艰难梭菌的MIC₅₀和MIC₉₀均明显低于万古霉素或甲硝唑，治疗减少艰难梭菌感染的复发率和综合治愈率显著优于万古霉素和甲硝唑，且产生抗性的倾向低，具有延长的抗生素后效应、治疗方案简单、交叉耐药性低和不良反应少等优点。

目前，制备非达霉素的制备方法，通常是采用非达霉素发酵菌发酵产生非达霉素，然后经过分离、纯化，由此得到高纯度的非达霉素。如CN200880009132公开了一种非达霉素的制备方法，该方法将大孔树脂加入到非达霉素发酵液中，在发酵完成后，首先通过筛析从培养基中分离固体物质（包括吸收剂树脂），用有机溶剂进行洗脱，减压浓缩得非达霉素粗品，粗品再经过反相二氧化硅柱层析（MeOH/H₂O/AcOH）、浓缩（浓缩至原始体积的三分之一）、过滤、干燥、结晶过程，可得到纯度为78-94.7%的非达霉素。该方法存在以下缺点：（1）发酵液过滤后树脂和菌丝体共存，筛分困难，树脂难于重复利用，环保处理困难；（2）洗脱液未经脱色除杂，直接得到粗提物，含杂质较多，对下游纯化介质造成的损伤大；（3）反相二氧化硅柱层析采用MeOH/H₂O/AcOH的三相洗脱系统，其中醋酸不仅会破坏柱体本身的键合相，降低反相柱的利用率，而且醋酸沸点较高为118℃，在回收溶剂时，水和甲醇可以回收完全，但是醋酸则只能回收一部分，这样一则回收的混合溶剂比例发生变化而无法重复使用，而造成生产成本提高，二则有一部分酸残留于浓缩液中，有可能会与非达霉素发生反应或残存于结晶液中而导致非达霉素精粉纯度降低。CN201110104051公开的非达霉素的制备方法，是反复经过大孔树脂、硅胶柱、凝胶柱、反相柱等层析柱进行分离，最后经薄层制备色谱进行富集。该方法的缺点是反复用多种层析柱，制备方法太复杂繁琐，而且经过多次层析柱分离亦会使收率低，另外使用薄层制备色谱进行富集，批处理量太小，不适于规模化生产。WO2011146621A2公开的一种高纯度非达霉素的制备方法，该方法用制备液相对非达霉素粗品进行制备，可得到纯度大于93%的非达霉素精粉，此方法虽然步骤简单，但是其所需设备比较昂贵，而且制备出的精粉量较少，不适合于工业化生产。 

发明内容

本发明的目的就是要提供一种操作简便、成本低廉，适于工业化规模生产的高纯度非达霉素的制备方法。 

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是： 

首先将非达霉素发酵液过滤、浸提，浸提液用水稀释后通过大孔树脂脱色、吸附、解析，所得解析液经浓缩、萃取、干燥后得非达霉素粗品；然后将非达霉素粗品用极性有机溶剂溶解，注入聚合物微球柱进行层析分离，得到高纯度的非达霉素精粉，具体制备步骤包括：

a）常温下将非达霉素发酵液过滤得到菌丝体，然后用极性有机溶剂浸泡菌丝体并进行固液分离，得非达霉素浸提液；

b）将上述非达霉素浸提液用水稀释后导入大孔脱色树脂柱中进行脱色处理，得非达霉素脱色液；

c）将非达霉素脱色液导入大孔吸附树脂柱中进行吸附，吸附饱和后的树脂用解析剂梯度解析，解析液浓缩、萃取、干燥后得到非达霉素粗品；

d）将非达霉素粗品用极性有机溶剂溶解，然后将溶解液注入聚合物微球层析柱，用洗脱剂进行梯度洗脱，收集洗脱液，合并HPLC测定非达霉素含量大于95%的洗脱液，浓缩、干燥后得到非达霉素精粉。

步骤a所述的极性有机溶剂，可选择乙醇、甲醇、丙醇、丁醇等溶液。其中以体积百分含量为80～95%的甲醇或乙醇溶液为优选。其加入量以每千克菌丝中加入2～4升为优选。 

本发明步骤b中的大孔脱色树脂可选用LX98、D301、D290、D303、LX-700，其中以LX98或D301树脂为优选。