[发明专利]一种提高枯草芽孢杆菌脂肪酶A热稳定性的方法

权利要求书

1. 一种提高枯草芽孢杆菌脂肪酶A热稳定性的方法，其特征在于包括如下步骤：

1)预测枯草芽孢杆菌脂肪酶A氨基酸突变的热点区域；

2)确定位于蛋白质表面且柔性较大区域的氨基酸位点；

3)结合步骤1)与2)分析确定与热稳定性相关的氨基酸突变位点；

4)基于对酶结构与功能关系的认知，采用分子模拟技术解析离子键引入对稳定枯草芽孢杆菌脂肪脂肪酶A蛋白结构的作用机制；

5)构建枯草芽孢杆菌脂肪酶A突变株，并验证突变株的热稳定性，得到热稳定性提高后的枯草芽孢杆菌脂肪酶A。

2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤1）所述的预测枯草芽孢杆菌脂肪酶A氨基酸突变的热点区域的方法为：利用HotSpot Wizard在线服务器，对超过50种枯草芽孢杆菌脂肪酶家族蛋白一级序列进行静态分析比对，获得枯草芽孢杆菌脂肪酶A每一个残基可突变率及突变结果，筛选突变率高的氨基酸残基位点，同时排除催化活性中心及底物通道周围的功能氨基酸，从而预测氨基酸突变的热点区域。

3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤2）所述的蛋白质表面且柔性较大区域的氨基酸位点的确定方法是：利用Pymol可视化软件与B-因子来得；利用分子动力学方法，获得枯草芽孢杆菌脂肪酶A的RMSF，从而确定枯草芽孢杆菌脂肪酶A柔性较大的区域，并结合Pymol可视化软件，确定位于蛋白质表面且柔性较大区域的氨基酸位点。

4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤3）所述的分析确定与热稳定性相关的氨基酸突变位点方法是结合步骤1)与2)分析确定与热稳定性相关的氨基酸突变位点：首先在于步骤2)后，得到的氨基酸位点突变可以选择性突遍为成天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸四种氨基酸残基的任意一种；再利用Pymol可视化软件，以该氨基酸为中心，在4?范围内寻找上述4种氨基酸中带相反电荷的氨基酸残基，从而确定突变位点及突变残基为：Gln60Lys、Gln60Asp、Gln60Glu、Gly111Asp、Ser167Asp、Asn174Glu、Gly175Lys。

5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤4）所述的基于对酶结构与功能关系的认知，采用分子模拟技术解析离子键引入对稳定枯草芽孢杆菌脂肪脂肪酶A蛋白结构的作用机制的方法为：所有的模拟和分析都用GROMACS 4.5.4进行，力场为GROMOS96 43a1，温度为500 K，pH=7.0；体系采用周期性立方体盒子，枯草芽孢杆菌脂肪酶A的周围填充水分子1.0 nm， 加入CL离子中和体系电荷，溶剂模型采用显式模型SPC；模拟首先进行5000步的最速下降法能量最小化；然后进行约束优化，约束枯草芽孢杆菌脂肪酶A，采用压力与温度，进行100 ps的平衡模拟；长程静电相互作用采用PME法，短程作用力的阀值为1.0 nm、范德华相互作用的截断值为1.0 nm，库仑相互作用的截断值为1.0 nm；最后进行分子动力学模拟，没有约束，模拟时间为7 ns，时间步长为2 fs；体系中各原子的坐标每1 ps收集1次；通过分析均方根偏差RMSD、均方根涨落RMSF、回转半径Rg、溶液可及表面积SAS、二级结构含量、氢键、盐键参数，来解析突变位点对枯草芽孢杆菌脂肪酶A热稳定的贡献，确定得到提高枯草芽孢杆菌脂肪酶A热稳定性的重要氨基酸位点是Asn174Glu。

6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤5）所述的分子生物学构建枯草芽孢杆菌脂肪酶A突变株的方法是采用全质粒扩增的方式进行突变：设计引物，引物上Asn174Glu，用prim STAR对全质粒进行扩增，突变质粒分别转入DH5α，涂布LB平板，转接到含有氨苄青霉素的LB液体培养基中；过夜培养，提取质粒，并转入BL21，涂布平板，构建枯草芽孢杆菌脂肪酶A突变菌。