[发明专利]一种生产法尼烯的菌株及其应用

说明书

技术领域

本发明属于合成生物学领域，涉及一种生产法尼烯的菌株及其应用。

背景技术

法尼烯最早从苹果树中分离得到，在植物防御方面起到重要作用。由于其是一种重要的化工原料，例如可用于人工合成橡胶，更重要的是法尼烯是一种优良生物能源法尼烷的前体，具有广阔的市场价值，近年来受到了人们的广泛关注。

法尼烯在植物中的含量非常低，无法以提取天然产物的方式来用于化工市场，因而利用微生物生产法尼烯似乎成为人们利用这一化合物的最佳方式。微生物发酵最大的瓶颈在于如何实现工业化，而工业化的必要条件是其产量需要满足可以工业化的水平。但是现在仅克隆到了少数几种法尼烯合酶，而且其在微生物中的蛋白表达情况都不理想，利用微生物生产法尼烯一直缓慢前行，未能实行工业化生产。现有报道（Wang,C.,et al.,2011.Metabolic engineering of Escherichia coli forα-farnesene production.Metabolic Engineering.13,648-655）法尼烯的最高产量仅为0.38g/L。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种生产法尼烯的菌株。

本发明的另一目的在于提供上述生产法尼烯的菌株的应用。

本发明的再一目的在于提供一种利用上述菌株生产法尼烯的方法。

本发明的目的还在于提供一种提高原核生物生产法尼烯能力的方法。

一种生产法尼烯的菌株，含有甲羟戊酸途径（MVA途径）和部分或全部经过密码子优化的法尼烯合成的相关基因；所述的甲羟戊酸途径的相关基因包括（1）将乙酰辅酶A缩合为乙酰乙酰辅酶A的基因atoB、（2）将乙酰辅酶A和乙酰乙酰辅酶A缩合为HMG-CoA的基因erg13、（3）将HMG-CoA还原为甲羟戊酸的基因thmg1、（4）将甲羟戊酸磷酸化为甲羟戊酸-5-磷酸的基因erg12、（5）将甲羟戊酸-5-磷酸磷酸化为甲羟戊酸-5-焦磷酸的基因erg8、（6）将甲羟戊酸-5-焦磷酸脱羧生成异戊烯焦磷酸的基因mvd1和（7）将异戊烯焦磷酸异构为二甲基烯丙基焦磷酸的基因idi；所述的法尼烯合成的相关基因包括（1）将异戊烯焦磷酸分子和二甲基烯丙基焦磷酸分子组合以形成法尼基焦磷酸的基因ispA和（2）将法尼基焦磷酸转化为法尼烯的基因afs。

所述的甲羟戊酸途径的相关基因优选为来源于大肠杆菌BL21（DE3）的atoB（CP001509.3:2216470-2217654）、idi（CP001509.3:2863926-2864474）和来源于酿酒酵母INVSC1的erg13（329138949:19060-20535）、tHMG1（329138949:115734-117239）、erg12（329138949:684467-685798）、erg8（329138949:712316-713671）、mvd1（329138953:701895-703085）。

所述的ispA基因优选为来源于大肠杆菌BL21(DE3)的ispA（CP001509.3:405603-406502）

所述的afs基因优选为以来源于苹果属的Malus x domestica(apple)的afs基因(Q84LB2)为基础进行密码子优化得到，其序列如SEQ ID NO.1所示。

优选的，所述的生产法尼烯的菌株为含有质粒pMH1、质粒pFZ81和质粒pFZ38的大肠杆菌；所述的质粒pMH1以pBBR1MCS为骨架载体、启动子为lac启动子、复制子替换为p15A复制子，包含atoB、erg13和thmg1基因，pMH1的序列（不含骨架载体序列）如SEQ ID NO.2所示；所述的质粒pFZ81以pBBR1MCS-2为骨架载体、启动子为lac启动子、复制子为质粒自带的pBBR1MCS复制子，包含erg12、erg8、mvd1和idi基因，pFZ81的序列（不含骨架载体序列）如SEQ ID NO.3所示；所述的质粒pFZ38以pET21a(+)为骨架载体、启动子为T7启动子、复制子pBBR322高拷贝复制子，包含afs和ispA基因，pFZ38的序列（不含骨架载体序列）如SEQ ID NO.4所示。

更优选的，所述的生产法尼烯的菌株为含有质粒pMH1、质粒pFZ81和质粒pFZ71的大肠杆菌；所述的质粒pFZ71以pET21a(+)为骨架载体、启动子为T7启动子、复制子pBBR322高拷贝复制子，包含afs、ispA和idi基因，pFZ71的序列（不含骨架载体序列）如SEQ ID NO.5所示。