[发明专利]一种可防治猪支原体肺炎的干细胞制剂的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物制剂制备领域，尤其涉及一种可防治猪支原体肺炎的干细胞制剂的制备方法。 

背景技术

猪支原体肺炎俗称猪气喘病，是由猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp)引起的一种慢性接触性呼吸道传染病，具有高发病率，低死亡率的特点。 

在新引进猪群多呈急性暴发，其发病率和死亡率常在20％以上，最急性型的死亡率可高达80％～100％。猪发病后可出现慢性干咳，生长缓慢，发育迟缓等特点，感染后可引起猪免疫力降低，从而导致其他病原如胸膜肺炎放线杆菌、猪繁殖与呼吸综合征病毒、肺炎巴氏杆菌等混合感染，引发猪呼吸道综合征(Percineres Piratory Disease Complex，PRDC)或者其他疾病。而且，猪肺炎支原体可通过空气传播，很难隔离阻断传播途径，极易引起全群发病，是公认的最难净化的猪病，严重危害养猪业的发展。 

到目前为止，对猪肺炎支原体感染的传染病尚无特效治疗药物。 

目前用于该病的免疫预防疫苗有2种，即灭活疫苗和弱毒疫苗，但都不能完全预防猪支原体肺炎发生。在临床治疗上过去多用土霉素和卡那霉素等，但疗效不稳定，停药后易复发，易形成僵猪。泰乐菌素(Tylosin)和替米考星(Tilmieosin)都是大环内酯类畜禽专用抗生素，对支原体有较好的疗效。但有研究报道，泰乐菌素对猪支原体肺炎仅有预防作用而无治疗效果，一旦停止用药，病情就会反复发作，使得当前养猪业对该药物产生了严重的依赖性，而这类药物的滥用又导致了支原体的耐药性，这进一步加剧了支原体感染病的流行和难 以控制。此外，据欧洲医药产品评价机构(EMEA)报道，替米考星在猪、羊体内，肝、肾中残留较高，而肌肉、脂肪、皮肤中残留较低(＜0.05mg/kg)，其原形为主要残留物，粪便中也存在微量代谢产物。因此，寻找一条新的无药物残留、无耐药性的净化猪肺炎支原体感染的有效途径显得尤为重要。 

据文献报道，β防御素有广谱高效抗支原体、革兰氏阳性、阴性菌、真菌和某些衣壳病毒的活性，且未见有耐药性。PBD-1是猪防御系统中起重要作用的抗菌肽，与其它抗微生物多肽相比具有特殊的抗病机理，不会产生耐药性，在动物体内及其产品中不会有药物残留的现象，并且已发现在猪的外周血单核细胞(PBMCs)和淋巴结细胞中具有很强的免疫调节作用，应用前景十分广泛，有望成为新一代抗支原体肺炎药物的理想选择。 

发明内容

本发明实施例的目的在于提供一种可防治猪支原体肺炎的干细胞制剂的制备方法，旨在解决目前抗生素药物易产生耐药性、在猪体内残留度高等问题。 

本发明实施例是这样实现的，一种可防治猪支原体肺炎的干细胞制剂的制备方法，该制备方法包括以下步骤： 

从初生猪腿骨骨髓中分离猪骨髓间充质干细胞； 

分离猪骨髓间充质干细胞的亚型细胞BMSC-S3细胞系； 

建立稳定转染PBD-1基因的BMSC-S3/PBD-1细胞系； 

PCR检测BMSC-S3/PBD-1细胞表达的基因； 

细胞免疫荧光化学分析和流式检测BMSC-S3/PBD-1细胞表达的抗原分子； 

在被诱导条件下，细胞可向成脂细胞或成肌细胞分化。 

进一步、从初生猪腿骨骨髓中分离猪骨髓间充质干细胞采用Ficol梯度分离法。 

进一步、分离猪骨髓间充质干细胞选取的部位为初生猪腿骨的胫骨、股骨。 

进一步、分离猪骨髓间充质干细胞的亚型细胞采用的方法为差速贴壁法。 

进一步、检测BMSC-S3/PBD-1细胞是否稳定表达PBD-1PCR的方法为PCR检测、细胞免疫荧光化学分析和流式检测。