[发明专利]一种锈斑蟳微卫星分子标记的筛选方法

说明书

技术领域

本发明属于锈斑蟳微卫星分子标记领域，特别涉及一种锈斑蟳微卫星分子标记的筛选方法。

背景技术

微卫星DNA(Microsatellite DNA)几乎存在于所有真核生物基因组中，由1-6个核苷酸组成的简单序列重复(Simple Sequence Repeats，SSR)，是近十几年发展起来的一种新型分子标记技术。微卫星具有数量多、随机分布、多态性高、重复性强、呈共显性遗传及操作简单等优点，被广泛地应用于群体遗传多样性分析、种质资源保护与管理、遗传连锁图谱构建及QTL定位等领域中。

国内外学者已在大多数的重要水产养殖动物中开发了微卫星标记。如：GUO等开发了大黄鱼的6个多态微卫星标记；李绍戊等开发了团头鲂的19个微卫星标记；马洪雨等报道了圆斑星鲽的40个多态微卫星标记和条斑星鲽的31个多态微卫星标记；Wang等开发了太平洋牡蛎的17个EST来源的多态微卫星标记；ELFSTROM等开发了扇贝的16个微卫星标记；Yap等筛选到梭子蟹的8个多态微卫星标记；An等筛选了中华绒螯蟹的9个微卫星标记。这些多态微卫星标记已经被广泛地应用到群体遗传结构分析、亲缘关系鉴定、遗传连锁图谱构建等研究中。

锈斑蟳(Charybdis feriatus)属节肢动物门(Arthropoda)、甲壳纲(Crustacea)、十足目(Decapoda)、梭子蟹科(Portunidae)、蟳属(Charybdis)，主要分布于太平洋、印度洋的热带、亚热带和温带沿岸，在我国主要分布于东南沿海各省，是我国重要的海洋渔业资源。为了鉴定和保护在我国广泛分布的锈斑蟳资源，有必要对其种群遗传结构和遗传多样性进行研究。微卫星标记是开展该方面研究的理想标记，但目前未有锈斑蟳微卫星标记可用，这种状况限制了锈斑蟳相关遗传学研究的开展。因此，非常有必要开发锈斑蟳微卫星分子标记。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种锈斑蟳微卫星分子标记的筛选方法，该方法操作简单、快速、准确、灵敏等优点，一周内可完成一个过程，大大提高了筛选微卫星标记的效率。

本发明的一种锈斑蟳微卫星分子标记的筛选方法，包括：

（1）提取锈斑蟳基因组DNA并稀释备用；

（2）设计5’锚定引物及PCR扩增；

（3）克隆扩增产物及测序；

（4）微卫星分子标记序列分析及微卫星特异引物设计；其中，微卫星分子标记及其对应的特异引物序列如下所示：

Cfe-1标记：如SEQ ID NO:1所示；

Cfe-1标记的特异引物序列：

F：ATGCTTGCTATTATTTTCTACTG；

R：GAGCAAATTAAGATTGACTGA；

Cfe-2标记：如SEQ ID NO:4所示；

Cfe-2标记的特异引物序列：

F：GAGTGGTAATGGGAGCAAATG；

R：TCCACATGCTCGTAAAACAAA；

Cfe-3标记：如SEQ ID NO:7所示；

Cfe-3标记的特异引物序列：

F：GGGATGTAAGACAATGTGAAC；

R：TTATACACCAATCTATATTAATTTC；

Cfe-4标记：如SEQ ID NO:10所示；

Cfe-4标记的特异引物序列：

F：ACCAGCCGTAATGCAGAACAC；

R：AAAACCCTGAGAAAGGATTGCA；

Cfe-5标记：如SEQ ID NO:13所示；

Cfe-5标记的特异引物序列：

F：CTTCCCCTTGGATGACGCTC；

R：GACTTAAACTCCCTTTGCTACCTG；

（5）使用引物对锈斑蟳不同个体的基因组DNA进行PCR扩增；

（6）使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测PCR扩增产物；

（7）根据扩增产物的不同迁移距离确定每个个体的基因型，从而获得锈斑蟳遗传变异的多态性图谱。