[发明专利]印度梨形孢发酵方法及所用的响应面优化法

说明书

技术领域

本发明涉及一种应用响应面法对印度梨形孢真菌的培养及次级代谢产物发酵生产工艺优化技术。

背景技术

丛枝菌根( arbuscular mycorrhizal, AM) 真菌能够与陆生植物形成共生关系，促进植物根系的养分吸收，提高植物对病虫害与贫瘠、干旱等逆境的抵抗能力，在一定程度上增加植物的生物量。常见的AM 真菌只能在活体植物上生存，但最近发现的植物根部内生真菌印度梨形孢(Piriformospora indica)却可以在人工培养基上生长并能顺利完成其生活史。研究发现印度梨形孢可以提高植物对高盐、干旱等逆境的抵抗能力，促进植物对土壤中营养元素的吸收，而且还能有效增强植物对各种病害的抗性，从而提高作物经济产量，因而被认为是一种生物防治因子和土壤改良因子，具有非常广阔的科研和商业开发前景。

印度梨形孢的培养一般是在马铃薯葡萄糖液体培养基（PDB）或固体培养基（PDA）中进行。由于现在对印度梨形孢的研究较少，文献对于该真菌的培养条件报道不一，其次级代谢产物的确定成分和结构尚不确定，因此国际上尚无关于印度梨形孢人工培养最优条件及大量发酵生产次级代谢产物的统一标准，这不利于该内生真菌的大规模工业化生产及农业应用。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种运用响应曲面法优化方法，优化印度梨形孢发酵条件，从而提高次级代谢产物产量的工艺；本发明对印度梨形胞发酵培养条件pH值、培养时间以及培养基浓度这三个对真菌生长和代谢产物产量有较大影响的因素进行优化，从而提高了次级代谢产物的得率，减少了营养成分及培养介质的消耗。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种印度梨形孢发酵方法，以PDB培养基（即马铃薯葡萄糖液体培养基）作为培养液，用浓度为1mol/L 的HCl溶液调节培养液的pH至5.0~5.1；然后放入印度梨形孢于27.5~28.5℃发酵培养14~15天；得发酵液。

作为本发明的印度梨形孢发酵方法的改进：调节培养液的pH至5，于28℃发酵培养14天。

作为本发明的印度梨形孢发酵方法的进一步改进：发酵液用乙酸乙酯进行萃取。

本发明还同时提供了一种响应面优化印度梨形孢发酵工艺的方法：设置以下3个变量：pH、PDB培养基的浓度和培养时间，以代谢产物在无水乙醇中的吸光度（浓度）作为响应值；利用design expert软件根据Box—Behnken设计原则进行优化。

采用本发明的印度梨形孢发酵方法，采用标准PDB培养基（浓度100%）作为培养液，当培养液的pH为5、于28℃发酵培养14天时，印度梨形孢发酵次生代谢物生产量最大，无水乙醇定容后的吸光度预测值（OD值）为0.647。

本发明是应用响应面分析法优化印度梨形孢培养条件从而提高次级代谢产物产量的方法。只通过15组实验就可对印度梨形孢培养条件的pH值，培养液浓度和发酵时间这些影响代谢产物产率的因素进行优化，获得最佳的提取优化条件，获得最佳产率，提高了发酵生产产率，降低了能耗，减少了污染物的排放，具有工业化生产的实际意义。

本发明只通过少量的实验，就可有效地优化印度梨形孢培养条件从而提高次级代谢产物产量，简便可行。

本发明可适用于工业化生产印度梨形孢代谢产物发酵生产工艺的优化的问题，具有很高的使用价值。

本发明具有如下优点和效率：

以乙酸乙酯为溶剂萃取印度梨形孢代谢产物，方法步骤简单，提取率高。

应用响应面分析法优化印度梨形孢培养条件从而提高次级代谢产物产量的；只通过15组实验就可以对真菌的培养条件工艺进行优化。

当pH=5，培养基浓度为标准PDB培养基（浓度比100%），发酵温度为28℃，发酵时间14 d时，印度梨形孢发酵次生代谢物生产量最大，定容后吸光度预测值为0.647。

本发明缩短了发酵时间，提高了发酵生产产率，降低了能耗，减少了污染物的排放，具有工业化生产的实际意义。

响应面分析法（RSM）是依据几个变量和一个或多个应变量之间的回归关系，通过回归分析得到提取条件和提取结果的回归关系，从而求得最佳提取工艺的一种数学方法。综上所述，本发明采用了响应面分析法，通过对培养液pH值，培养液浓度和培养时间进行了优化分析，从而设计出最佳的真菌次级代谢产物发酵条件，提高代谢产物的最终产量。目前利用该方法设计优化真菌最佳培养发酵条件，从而提高代谢产物产量的方法尚未见报道。

在本发明中：