[发明专利]一种星斑川鲽精子超低温冷冻保存方法

权利要求书

1.一种星斑川鲽精子超低温冷冻保存方法，其特征在于：将星斑川鲽的精液与抗冻液按体积比1:3的比例混合，在0℃孵育6-8分钟，孵育后以分段方式降温处理；处理后投入到液氮（-196℃），分装保存；

所述抗冻液由稀释液、抗冻剂和添加剂组成；其中，稀释液为100mM蔗糖，100mM KHCO₃，25mM NaHCO₃；抗冻剂为终浓度8%的（V/V）DMSO（二甲基亚砜）和终浓度7%的（V/V）Gly（甘油）；添加剂：5mM还原型谷胱甘肽，50mM牛磺酸，10%蛋黄（V/V）。

2.按权利要求1所述的星斑川鲽精子超低温冷冻保存方法，其特征在于：所述抗冻液在使用前放置于0℃冰箱中预冷过夜，待用。

3.按权利要求1所述的星斑川鲽精子超低温冷冻保存方法，其特征在于：所述冻存管为2ml或5ml的冻存管。

4.按权利要求1所述的星斑川鲽精子超低温冷冻保存方法，其特征在于：所述蛋黄由鸡蛋分离蛋白并搅拌均匀所得。

5.权利要求1所述的星斑川鲽精子超低温冷冻保存方法，其特征在于：将混合抗冻液和精液的冻存管置于碎冰中（0℃）轻轻震荡混匀6min，使之充分混匀，然后置于0℃平衡2min；而后以分段降温方式处理，即以-8℃/min的降温速率降温至-60℃，然后再以-15℃/min的降温速率降温至-120℃平衡2分钟。

6.权利要求1所述的星斑川鲽精子超低温冷冻保存方法，其特征在于：所述星斑川鲽的精液是采集处于繁殖期的星斑川鲽雄鱼，将雄鱼从养殖池中捞出，放置于海绵上，蒸馏水冲洗生殖孔、擦净，轻轻挤压腹部获得新鲜精液，而后将活力高于85%的精液与抗冻液混合。

7.权利要求1所述的星斑川鲽精子超低温冷冻保存方法，其特征在于：将经液氮处理分装保存的星斑川鲽冻精进行解冻，将其直接放入37℃水浴100s，然后置于室温至完全融化，而后于自然海水中激活。

8.权利要求1所述的星斑川鲽精子超低温冷冻保存方法，其特征在于：所述冻精进行解冻直接放入37℃水浴100s，期间不断摇动冻存管。