[发明专利]鼠伤寒沙门氏菌X3337-pRST98lux及其在活体成像中的应用

说明书

技术领域

本发明属于微生物技术领域，特别涉及鼠伤寒沙门氏菌X3337-pR_ST98lux及其在活体成像中的应用。 

背景技术

沙门菌(Salmonella)是一类危害人和动物健康的重要致病菌，在自然界分布广泛，主要经水和食物传播，可引起人类和动物多种疾病。沙门菌病是公共卫生学上具有重要意义的人畜共患病，我国由沙门菌引起的食物中毒占细菌性食物中毒的70～80%，可导致医院感染和暴发性食物中毒，病死率较高。其致病机制和防治方法是目前医学、食品安全、农业和畜牧业领域研究的热点。伤寒沙门菌（Salmonella typhi）所致的人类伤寒目前在发展中国家每年仍有2100万病例，其中死亡人数超过20万，甚至在发达国家仍时有暴发流行。尽管在我国伤寒的发病率得到一定控制，但部分省份（贵州、云南、广西、浙江、江苏、新疆等）的发病仍高居不下，暴发时有发生。现代食品加工业的日益国际化和贸易流通为沙门菌的传播创造了条件，由于抗生素的滥用多重耐药沙门菌频频出现，近年来数次重大自然灾害的发生，沙门菌感染作为食源性疾病的代表是灾后重点防治的传染病。近年来，伤寒的爆发流行呈现新的变化，表现为沙门菌质粒携带的各种耐药基因和毒力基因可通过接合、转化和转导等方式在细菌间转移，使沙门菌耐药株增加，毒力增强，导致临床对伤寒的治疗愈加困难。因此，深入研究沙门菌致病机制对预防其感染及控制流行具有重要意义。 

伤寒沙门菌由于其严格宿主特异性，只感染人类及高等灵长目，缺乏合适的动物模型在活体内开展其致病机制的研究，而同属的鼠伤寒沙门氏菌宿主范围广，既感染动物也可感染人。早在1908年，Levy等人已证实在鼠伤寒沙门氏菌建立的小鼠感染模型中，细菌在小鼠脏器中的分布与伤寒沙门菌在伤寒患者体内的分布情况一致，且小鼠脏器病变及炎症反应与伤寒患者体内观察到的也极为相似。近几十年来各国学者多用鼠伤寒沙门氏菌在小鼠体内的动态变化来推测人类伤寒热的发病情况，因此，在小鼠中研究鼠伤寒沙门氏菌的致病机制有助于深入探索伤寒热、食物中毒及胃肠炎等疾病的防治策略。 

本课题组对沙门菌的研究已有20余年的历史。二十世纪八十年代中后期，我国十三省市暴发了多重耐药伤寒的严重流行。本实验室对临床分离的591株伤寒沙门菌进行的系列检测，发现所有多重耐药菌均携带一个分子量为98.6×10⁶道尔顿（98.6Md，约159Kb）的可接合 传递的大质粒，可编码对10余种药物的抗性，属不相容性C群（IncC），称之为pR_ST98。针对该次耐药伤寒暴发流行来势凶猛、患者病情重、并发症多、病死率高的特殊性，我们对pR_ST98的生物学特性进行了研究，证实在体外携带该质粒的伤寒沙门菌在血清中的抗性显著增强，其抵抗巨噬细胞吞噬杀伤和在细胞中生存的能力明显升高。既往文献报道，除伤寒沙门菌外所有致病沙门菌都有毒力质粒，在质粒上均有约8Kb的与细菌血清抗性、粘附和定居有关的高度保守序列——沙门菌质粒毒力基因（Salmonella plasmid virulence genes，spv）。在后续研究中，我们用Southern Blot、PCR和核酸测序证实，伤寒沙门菌pR_ST98上存在与spv同源性达99.6%的毒力基因，从细菌表型和核酸水平在国内外首次报道了pR_ST98是既能介导细菌耐药性又能增强细菌毒力的具有双重功能的“嵌合型”质粒。 

鉴于感染的发生和发展过程极其复杂，由体内多种因素参与调节，动物模型的研究对深入了解细菌的致病机制更接近于自然感染。由于伤寒沙门菌是一种严格只对人类致病的病原体,没有合适的动物模型,我们通过接合转移将pR_ST98导入与伤寒沙门菌非常近缘的鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)，构建接合子作为研究对象，建立小鼠体内感染模型，深入研究pR_ST98的功能。传统的方法是将鼠伤寒沙门氏菌经口、腹腔等途径感染小鼠后，间隔不同时间段将小鼠处死，解剖后检测各种器官的病理变化，计数细菌在脏器内的数量，观察细菌在单核吞噬细胞系统内的生存情况等，以反映沙门菌的致病特点和机体的免疫应答。结果发现该质粒能使宿主菌对小鼠的LD₅₀降低，小鼠肠系膜淋巴结、肝脏和脾脏菌量明显增加并出现严重病理改变，从而证实该质粒具有多效性，除编码抗药性外还能增强宿主菌的毒力。