[发明专利]一种利用蓝藻生产咖啡酸的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用蓝藻生产咖啡酸的方法，特别涉及一种利用集胞藻Synechocystis sp.PCC6803生产咖啡酸的方法，属于基因工程技术领域。

背景技术

咖啡酸是植物遭受外界刺激（如病原菌的侵染、植物体出现伤口、紫外照射、强光逆境、营养不足及低温等条件）而产生的一种苯丙烷类次生代谢物。咖啡酸及其衍生物咖啡酸苯乙基酯等具有强抗氧化、抗癌、抗炎和免疫调节活性（Gulcin,2006;Rajendra et al.,2011;Chao et al.,2009;Park et al.,2004）,是一种在医学上具有较广泛作用的医药中间体和原料药。

咖啡酸具有抗菌抗病毒作用，还具有较广泛的抑菌作用，但在体内能被蛋白质灭活。实验表明体外对牛痘和腺病毒抑制作用较强，对腺病毒和副流感都有抑制作用，其次为脊髓灰质炎Ⅰ型和副流感Ⅱ型病毒。在抗蛇毒等方面作用显著,实验数据显示3μg咖啡酸剂量即能完全抑制20μg响尾蛇毒磷酸二酯酶，可用来生产抗蛇毒药物。另外，咖啡酸具有收缩增固微血管、提高凝血因子的功能、升高白细胞和血小板的作用，可以用来生产治疗血小板减少性紫癜和其他原因引起的白细胞减少症、血小板减少症的药物。除此之外，咖啡酸具有抗早孕作用,可以用来生产副作用更小，成本更低的避孕药；咖啡酸也常用于合成降血糖、降血压药物。

目前咖啡酸的生产主要是从菊科植物一枝黄花中提取或是化学合成。自然提取方法的生产面临着植物资源、土地资源限制、提取成本高及得率低的限制。而化学合成则面临着能源消耗，成本高，环境污染严重的境地。

蓝藻（Synechocystis sp.），又名蓝细菌，是一类光合自养的原核生物。它结构简单、生长迅速、适应性强、易于进行遗传操作，并且多数不含毒蛋白，可作为很好的基因工程受体系统。作为基因工程受体，与大肠杆菌相比其表达产物不形成包涵体，容易纯化；不含毒素，比较安全；培养基为无机盐，廉价不易污染等优势。但由于蓝藻表达目的基因具有不确定性，因此，目前并未有利用蓝藻制备咖啡酸的相关报道。

发明内容

本发明针对现有生产技术的不足，提供了一种利用蓝藻生产咖啡酸的方法。

一种利用蓝藻生产咖啡酸的方法，步骤如下：

（1）将核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示的上臂基因插入质粒pBluescript II SK+的KpnI-XhoI内切酶酶切位点之间，将核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示的下臂基因插入质粒pBluescript II SK+的SpeI-SacII内切酶酶切位点之间，将核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示的卡纳抗性片段插入质粒pBluescript II SK+的BamHI-PstI内切酶酶切位点之间，将核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示的PsbA2启动子插入质粒pBluescript II SK+的SalI-EcoRI内切酶酶切位点之间，将核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示的5ST1T2PCR转录终止子插入质粒pBluescript II SK+的PstI-SmaI内切酶酶切位点之间，制得重组空白质粒；

（2）将核苷酸序列如SEQ ID NO.1所述的基因片段插入步骤（1）制得的重组空白质粒的EcoRI-PstI内切酶酶切位点之间，制得重组质粒；

（3）将步骤（2）制得的重组质粒转化集胞藻Synechocystis sp.PCC6803，制得转基因集胞藻；

（4）将步骤（3）制得的转基因集胞藻扩大培养后，经提取，制得咖啡酸。

根据本发明优选的，所述步骤（4）的扩大培养，步骤如下：

将转基因集胞藻接种于BG-11液体培养基中，制得原藻液，在28～32℃的条件下培养至OD₇₃₀值为0.6～0.8时，经3000rpm离心10min，收集藻细胞，然后用原藻液1/10体积的新鲜BG-11液体培养基悬浮藻细胞，并添加对香豆酸至终浓度为0.5μM/L，置于28～32℃的条件下培养3天，收集培养液。在藻细胞对数生长期时以1/10体积浓缩藻细胞后，添加对香豆酸，能够起到细胞富集、减少对香豆酸的耗费以及减少后期咖啡酸萃取过程的有机溶剂的使用量。

根据本发明进一步优选的，所述的BG-11液体培养基，每升组分如下：