[发明专利]SGC-7901细胞表面特异性结合的多肽

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，涉及筛选肿瘤组织特异性结合肽，特别是一种SGC-7901细胞表面特异性结合的多肽。

背景技术

胃癌（gastric cancer）是消化道常见的恶性肿瘤之一，其恶性程度高、早期诊断率低、预后效果差，术后复发和转移是影响胃癌预后的主要原因。因此，探究胃癌发生、发展的细胞和分子生物学机理对当前胃癌治疗至关重要，同时，寻找敏感性高、特异性强的早期诊断方法也是目前降低胃癌死亡率的一个首选策略。近年来，分子影像学和靶向治疗的迅速发展为胃癌治疗找到了新的希望，其中，从胃癌细胞表面筛选特异、敏感的肿瘤标记物已经成为实验室工作的当务之急，噬菌体展示技术的创立为研究胃癌细胞表面肿瘤标记物的局限性开创了新局面，为胃癌的早期诊断和靶向治疗研究奠定了基础。

噬菌体展示技术（Phage Display Technology）是一项特异性多肽或蛋白的筛选技术，1985年由美国Missouri大学G.P.Smith等首创，此技术可将目的基因编码的多肽以融合蛋白的形式展示于噬菌体表面，被展示的多肽或蛋白可以保持相对独立的空间结构和生物活性，使大量随机多肽与其DNA编码序列之间建立了直接联系，使得各种靶分子（如抗体、酶和细胞表面受体等）的多肽配体通过体外亲和淘选程序得以快速鉴定。噬菌体展示技术已被广泛用于肿瘤诊断标志物和抗肿瘤先导化合物的筛选、肿瘤特异性抗体和肿瘤药物靶向运输等方面的研究。

噬菌体展示技术正逐步发展成熟，为获取对癌症诊断和治疗有价值的多肽或抗体提供了重要手段。目前已发现多种与肿瘤相关的基因和抗原，肿瘤相关配体和多肽的筛选已成为寻找抗肿瘤药物的新热点，针对肿瘤细胞不同表达分子的特异性结合多肽，为肿瘤治疗提供了新的靶点，也为放射标记的肿瘤检测、化疗药物的给药、药物敏感实验及肿瘤的免疫治疗提供了新的分子靶位，噬菌体多肽还具有抑制肿瘤相关基因转录、阻碍肿瘤新生血管生成和转移及诱导肿瘤细胞凋亡等作用，将多肽与脂质体或纳米药物偶联，既有助于在达到更好的靶向治疗效果，又减小了药物的毒副作用，还可用于肿瘤血管三维成像和分子影像技术的检测及肿瘤治疗疗效评价。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种SGC-7901细胞表面特异性结合的多肽及其筛选方法，该方法利用噬菌体展示随机十二肽库筛选得到5条多肽片段，并通过鉴定它们与胃癌细胞的亲和力和特异性，分析氨基酸序列组成。

为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案：

SGC-7901细胞表面特异性结合的多肽，其特征在于，利用噬菌体展示随机十二肽库筛选得到14个肽序克隆，从中获得5条共同多肽片段，其氨基酸序列分别为：YTHNESSPKDTH，YTVPDYKHNSAH，THPWQITSVNFK，DVFPHSRPADEL，IHKDPANKSLVP。

五条多肽的亲水性分析表明，它们均为亲水性多肽。且5条多肽片段的氨基酸序列具有一定的同源性。

5条多肽片段能够特异性结合SGC-7901细胞，而不识别人胚肾HEK293细胞。

上述SGC-7901细胞表面特异性结合的多肽的筛选方法，该方法利用噬菌体随机十二肽库，以体外培养的胃癌SGC-7901细胞系为靶细胞，以人胚肾细胞HEK293细胞系为吸附细胞，进行4轮全细胞消减筛选，随机挑取30个噬菌体克隆扩增并滴定，利用酶联免疫吸附实验鉴定阳性克隆，比较阳性克隆与SGC-7901细胞的亲和力，排除假阳性克隆，提取阳性噬菌体克隆单链DNA测序，分析多肽的氨基酸序列的基本特征，多肽同源性比较，检索出现频率高的多肽基序，BLAST检索蛋白质数据库，检测多肽基序同源性较高的蛋白质，及可能结合的细胞表面受体和配体；细胞免疫荧光法检测噬菌体多肽克隆的靶向性，进一步鉴定阳性克隆的特异性。

本发明利用噬菌体多肽展示技术筛选胃癌SGC-7901细胞结合的多肽序列，ELISA鉴定噬菌体克隆与胃癌细胞的亲和力，获得14个阳性噬菌体克隆，测序获得5条共同多肽序列。同源性分析表明这些多肽可能为胃癌细胞表面受体结合的配体蛋白上的氨基酸决定簇，细胞免疫荧光进一步鉴定噬菌体阳性克隆的靶向性结果提示噬菌体阳性克隆能够特异性结合SGC-7901细胞，筛选获得的胃癌SGC-7901细胞特异性多肽为胃癌的早期诊断、抗肿瘤药物的靶向运输及靶向短肽药物的研发提供了实验依据。

附图说明

图1是本发明的具体技术路线图；

图2是随机十二肽pIII融合蛋白的N末端序列；

图3是精简遗传密码表；