[发明专利]产蛋白酶菌株微小杆菌属及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及深海来源的蛋白酶生产菌株，具体涉及微小杆菌属（Exiguobacterium sp.）SWJS2及其液体发酵产蛋白酶的方法。

背景技术

蛋白酶是分解蛋白质肽键的一类酶，与人类的生活息息相关，在全球酶制剂销售总额中占60%以上，但其更广泛的应用受到生产成本和酶学特性的制约，因此探索新型的蛋白酶资源及高产蛋白酶的菌种一直受到研究者们的关注。随着人类对生物资源的多样性及特异性需求的不断增加，已有的陆地资源在被不断挖掘的同时仍不能满足人类对新资源的的需求，研究者们将目光投向了极具潜力的海洋生物资源。海洋环境普遍具有高盐、高压、低温、低光照、寡营养等特性，并存在着局部高温、高酸、高碱、高辐射等极端环境，使得海洋微生物与陆生微生物在代谢系统和防御体上存在明显的差异，可能产生多种具有特殊结构和功能的生物活性物质。自1972年Nabou Kato等首次报道了海洋细菌Peseudomoas sp. No.548产生蛋白酶后，国内外许多课题组对海洋微生物来源的蛋白酶进行了研究，主要集中在新的产酶微生物及新型蛋白酶如适冷蛋白酶、高温蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶等方面。

目前已发现的产蛋白酶的海洋细菌主要包括假单胞菌属、黄杆菌属、芽孢杆菌属、弧菌属、氧化短杆菌属等，深海来源的产蛋白酶的微小杆菌属尚未有报道。微小杆菌属可应用于生产乳酸、降解三苯甲烷类染料孔雀绿、降解阿特拉津等，其产蛋白酶的研究有少量报道。石卉等从腐败的碱性硅溶胶中分离出一株产碱性蛋白酶的金橙黄微小杆菌，优化条件下酶活为37.793U/mL。Kasana等从西部喜马拉牙雅山的土壤中分离出了微小杆菌属Exiguobacterium sp. SKPB5 (MTCC 7803)，所产蛋白酶最适温度为50℃，最适pH为8.0，酶活为1.46 U/mg 蛋白。Lee等从土壤样品中分离得到产碱性蛋白酶的Exiguobacteriumsp. YS1，酶活为150 U/mL左右。本发明中涉及的微小杆菌属（Exiguobacteriumsp.）SWJS2产中性蛋白酶活达600U/mL以上，遗传性质稳定，酶学性质与所报道的有差异，有巨大的工业应用的潜力。

发明内容

本发明的目的是提供一个深海来源、高产蛋白酶的微生物菌株，及其液体发酵产蛋白酶的应用。

本发明的产蛋白酶菌株微小杆菌属分离自南海深海海泥样品，采用酪蛋白平板初筛和摇瓶发酵复筛筛选得到，分类命名为微小杆菌属（Exiguobacterium sp.）SWJS2。该菌株已于2013年3月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中科院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.7387。

经形态鉴定及生物生化特性研究，保藏编号为CGMCC No.7387的菌株具有以下特征：（1）菌落形态：菌落呈圆形，直径较小，光滑湿润，边缘整齐，淡橙黄色；（2）细胞形态：革兰氏染色阳性，生长早期全部呈杆状，后期部分细胞呈球状，无鞭毛，不产芽孢；（3）生理生化特征：需氧生长，能利用葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、甘露醇，不能利用D-山梨醇，淀粉水解阳性、明胶液化阳性、甲基红试验阴性、V-P试验阴性、靛基质试验阴性、硝酸盐还原阴性、接触酶阳性、氧化酶阴性，不产氨，不产H₂S。

对保藏编号为CGMCC No.7387菌株的16S rRNA基因进行PCR扩增与序列测定，测得16S rRNA基因片段长度为1455bp，具体序列见序列表。该基因序列与Genbank中已登录的基因序列进行分析得知，该菌株与Exiguobacterium acetylicum strain QD-3(FJ970034.1)相似性最高，同源性达99%。结合16S rRNA基因序列相似性及形态、生理生化特征，鉴定该菌株为微小杆菌属（Exiguobacteriumsp.）。

本发明还提供了产蛋白酶菌株微小杆菌属（Exiguobacterium sp.）SWJS2在液体发酵生产蛋白酶中的应用。本发明采用单因素试验对保藏编号为CGMCC No.7387菌株液体发酵产蛋白酶的条件进行了优化。

本发明采用单因素试验优化了产蛋白酶的条件，其培养条件简单，易培养，遗传性质稳定。关于微小杆菌属产蛋白酶的研究还比较少，加上其来自深海的特殊环境，可能成为新型蛋白酶资源的生产菌种，具有重要的后续开发及工业应用价值。