[发明专利]荧光假单胞菌及其在生物合成蛋氨酸中的应用

说明书

（一）技术领域

本发明涉及一株产腈水解酶菌株——荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）ZJB-12001，及其在生物转化2-氨基-4-甲硫基丁腈合成蛋氨酸中的应用。

（二）背景技术

蛋氨酸（Methionine）又名甲硫氨酸，化学名称为2-氨基-4-甲硫基丁酸，分子式为C₅H₁₁NO₂S，外观为白色片状结晶或粉末，有特殊气味，味微甜，熔点281℃（分解），相对密度1.34，溶于水、稀酸和稀碱，微溶于醇，不溶于醚，1%蛋氨酸水溶液的pH值为5.6～6.1，对热和空气稳定，对强酸不稳定，可导致脱甲基作用。蛋氨酸含有一个氨基和羧基，是唯一含硫的氨基酸，具有旋光性，分为D型和L型，在动物体内，L型的易被肠道吸收，D型的要经酶转化为L型的，才能被利用。

蛋氨酸是动物营养中一种非常重要的限制性必需氨基酸。常作为一种重要的蛋白质饲料的强化剂和弥补氨基酸平衡的营养添加剂，在配合饲料特别是禽类饲料中，蛋氨酸是第一限制氨基酸。它可促进禽畜生长、增加瘦肉量、缩短饲养周期，加有蛋氨酸的动物饲料能在短时间内帮助动物快速成长，节省大约40％的饲料。除此之外，蛋氨酸可抑制肝脏和动脉中脂肪的积累，促进脂质的代谢和大脑、心脏、肾的血液循环、促进消化、解毒、排泄毒性物质、重金属等；每天使用量为800～1600mg时，可抗抑郁；在骨、关节疾病中有抗炎症的作用，并促进关节的康复；防脱发等。因此，蛋氨酸广泛应用于饲料、医药、食品和化妆品等领域，其中饲料添加剂的用量最大。

目前，蛋氨酸的生产方法主要为化学合成法，如海因法、氨基内酯法、丙二酸酯法、固液相转移催化法等：

（1）海因法：丙烯醛和甲硫醇在催化剂作用下进行加成反应生成甲硫基丙醛;甲硫基丙醛与NaCN或HCN、NH₄HCO₃发生缩合反应制得甲硫基乙基乙内酰脲(海因);而后甲硫基乙基乙内酰脲在NaOH或K₂CO₃作用下水解生成蛋氨酸钠/钾盐;进一步采用H₂SO₄、HCl或CO酸化即得DL-蛋氨酸，最后浓缩、结晶、分离得到蛋氨酸成品。海因法工艺技术成熟、反应收率高、自动化程度高;副产物如硫酸钠、二氧化碳、氨等均可在工艺过程中循环，因此，海因法工艺成为国外大多数蛋氨酸生产厂家美国诺伟思公司、法国罗纳-普朗克公司和德固赛公司、日本曹达和住友公司等普遍采用的生产方法。

（2）氨基内酯法：氨基内酯法又名γ-丁内酯法，主要以γ-丁基内酯为原料合成蛋氨酸。γ-丁基内酯溴化得到α,γ-二溴丁酸，加热进行缩合反应生成α-溴-γ-丁基内酯，用液氨处理得到α-氨基-γ-丁基内酯，最后与甲硫醇钠进行反应制得DL-蛋氨酸，产率为40%。

（3）丙二酸酯法：丙二酸酯法主要以2-甲硫基氯化乙烷和邻苯二甲酰亚胺基丙二酸乙酯钠盐、乙基乙酰胺基氰基乙酸盐、二乙基乙酰氨基丙二酸盐、乙基乙酰乙酸酯其中之一为原料制备蛋氨酸，产率分别为58%、48%、60.5%、70%，其中将2-甲硫基氯化乙烷和乙基乙酰乙酸酯进行反应，得到β-甲硫乙基乙酰乙酸乙酯，然后与NH₃反应，随后使用NaOH水解得到蛋氨酸亚砜，使用硫酸钙还原蛋氨酸亚砜值得DL-蛋氨酸，产率达到70%。

（4）固液相转移催化法：在甘氨酸乙酯盐酸盐、苯甲醛、无水硫酸镁、二氯甲烷的混合液中滴加催化剂三乙胺制备苯亚甲氨基乙酸乙酯，苯亚甲氨基乙酸乙酯和2-氯乙基甲基硫醚在氢氧化钾和无水碳酸钾的皂化作用下合成苯亚甲氨基甲乙硫醚基乙酸乙酯，最后使用浓盐酸水解得到蛋氨酸，产率达到59%。

尽管目前化学合成蛋氨酸工艺较为成熟，相对以前副产物的生成量有所减少，或回收重复利用，但是依旧不可避免的使用了具有腐蚀性的酸、碱等危险化合物，产生了各种硫酸盐，这不仅需增加额外的费用回收处理盐，而且增加了投资设备，不符合绿色化学和原子经济的要求。也有一些学者在研究通过发酵法生产蛋氨酸，尽管发酵法生产的蛋氨酸都是L型的，但是该途径存在严重的反馈抑制，产量小，收率极低，成本较高，工业化迟缓，尚不具备工业化价值。微生物酶法转化具有原料成本低、流程简单、设备投资少、反应条件温和、副产物少、环境污染小等优点，符合绿色化学和原子经济的要求，因此，对比之下，微生物酶法转化生产蛋氨酸具有很大的应用前景。

（三）发明内容