[发明专利]太平洋鳕鱼精子高效超低温冷冻保存方法

权利要求书

1.一种太平洋鳕鱼精子高效超低温冷冻保存方法，其特征在于：

将太平洋鳕鱼精液与抗冻液以1:4-1:3的体积比例混合，混合后在0-4℃孵育平衡8-10分钟；孵育后以分段方式降温处理；处理后投入到液氮（-196℃），分装保存；

所述抗冻液由稀释液、抗冻剂、添加剂组成，其中稀释液为：NaCl 8g/L，Na₂HPO₄·2H₂O0.6g/L，KH₂PO₄0.6g/L，海藻糖37.8g/L；抗冻剂为终浓度10%（V/V）的丙二醇（PG）；添加剂为：终浓度5%（V/V）的蛋黄和终浓度5%BSA（V/V）。

2.按权利要求1所述太平洋鳕鱼精子高效超低温冷冻保存方法，其特征在于：所述抗冻液在使用前放置于0℃冰箱中预冷过夜，待用。

3.按权利要求1所述太平洋鳕鱼精子高效超低温冷冻保存方法，其特征在于：所述经抗冻液混合的大菱鲆的精液置于2ml或5ml的冻存管中。

4.按权利要求1所述太平洋鳕鱼精子高效超低温冷冻保存方法，其特征在于：所述采集处于繁殖期的太平洋鳕鱼雄鱼，将生殖孔微微发红的雄鱼从养殖池中捞出，放置于海绵上，蒸馏水冲洗生殖孔三次，用洁净的纸巾擦净，拇指与食指轻轻沿着精巢的位置从后向前挤压，用5ml的一次性吸管采集新鲜精液鱼5ml的离心管中，避光存放于0-4℃的冰盒中，取活力高于80%精液，保存待用。

5.按权利要求1所述太平洋鳕鱼精子高效超低温冷冻保存方法，其特征在于：所述太平洋鳕鱼的精液与抗冻液在碎冰中（0℃）轻轻震荡、充分混匀3-5min，然后以-5℃/min降温至-60℃，然后再以-10℃/min降温至-120℃平衡3min直接投入到液氮（-196℃）中保存。

6.按权利要求1所述太平洋鳕鱼精子高效超低温冷冻保存方法，其特征在于：将经液氮冷冻保存的太平洋鳕鱼冻精进行解冻，将其直接放入35-40℃水浴90-120s，然后置于室温18-20℃完全融解，而后于自然海水中激活。