[发明专利]利用原位合成微流体芯片检测转基因番茄的方法

权利要求书

1.利用原位合成微流体芯片检测转基因番茄的方法，其特征是包括以下步骤：

1）、转基因番茄外源基因检测的芯片探针的设计；

2）、制备寡聚核苷酸芯片；

3）、待测番茄样品中基因组DNA的提取；

4）、基因组特定片段或整个基因组荧光标记；

5）、芯片杂交；

6）、判定样品是否为转基因番茄品种。

2.根据权利要求1所述的利用原位合成微流体芯片检测转基因番茄的方法，其特征是，所述步骤1）为：设计合成了如表1所述的895条寡核苷酸探针。

3.根据权利要求1或2所述的利用原位合成微流体芯片检测转基因番茄的方法，其特征是，所述步骤2）为：

制备寡聚核苷酸芯片：先在原位合成微流体芯片上，依次合成化学修饰过的957条寡核苷酸探针序列；然后对合成好的芯片在芯片扫描仪上进行荧光分析，以检测芯片本身的荧光本底；再用质控cDNA或来自于质粒的DNA片段进行荧光标记后，与芯片进行杂交，分析芯片特异性、灵敏度和重复性，评估芯片质量。

4.根据权利要求3所述的利用原位合成微流体芯片检测转基因番茄的方法，其特征是，所述步骤3）为待测番茄样品中基因组DNA的提取：

取0.1-0.2g番茄样品，液氮研磨，装入1.5 ml 无菌的eppendorf管中；加入1ml CTAB提取液，于65℃水浴60-90min；离心取上清，加入酚/氯仿/异戊醇（体积比为25：24：1，共计用量为上清体积的2/3），充分混匀，离心取上清；加入氯仿/异戊醇，离心取上清；加入NaAC溶液和无水乙醇沉淀；离心弃上清，体积浓度为70%的酒精洗涤沉淀；离心弃上清，真空干燥；加入50-100 μ1 TE溶液溶解DNA。

5.根据权利要求4所述的利用原位合成微流体芯片检测转基因番茄的方法，其特征是，所述步骤4）为基因组特定片段或整个基因组荧光标记，可选用以下3种方法中的任意一种：

方法A、以待检番茄样品DNA为模板，设计并筛选出转基因番茄中常用的启动子、终止子、报告基因、以及番茄种属内参照基因的引物，进行PCR反应，并对其进行CY3荧光标记；PCR反应体系中以CY3标记的dCTP代替普通dCTP；具体引物信息：35s-F/R: 5＇-GCTCCTACAAATGCCATCA-3＇/5＇-GATAGTGGGATTGTGCGTCA-3＇; nos-F/R: 5＇-GAATCCTGTTGCCGGTCTTG-3＇/5＇-TTATCCTAGTTTGCGCGCTA-3＇; 35s-EFE-F/R: 5＇-TGGGATCTAAGCACTTGCAATTGGA-3＇/5＇-GCACAAACAGACGGGACACGAAT-3＇; nptII-F/R:5＇-GAAAAATACCGCTGCGTAAAAG-3＇/5＇-TCAGGGCTTTGTTCATCTTCAT-3＇; acc-F/R:5＇-TTTTGCCTCGCTGATCCTGGC-3＇/5＇-GGTTTCGCCTTTCGGCTTCTGT-3＇; cry1AC-F/R:5＇-TCATCCCTTACGTCAGTGGAG-3＇/5＇-CCATCATTGCGATAAAGGAAA-3＇; lat52-F/R:5＇-ATGCAGGAACATCAGCACAGAGGC-3＇/5＇-TCTTTGCAGTCCTCCCTTGGGCTT-3＇; mcpi-F/R: 5＇-TGGCACAAGATGCAACTCTGACGA-3＇/ 5＇-ACAGGCCTGACAGAACGTACCA-3＇; apx-F/R: 5＇-CTCTTGGAGCCCATTAGGGAGCA-3＇/ 5＇-TTGGAAGTAAGCACTACTTAGTAGTCATCAC-3＇; fru-F/R: 5＇-GGTAGTTCAGTACCTGTGTTGGACG-3＇/ 5＇-TGACATCTAATCCTAAGGTAGGGCG-3＇;

方法B、在方法A所用正向引物的5’端插入接头Head-F (gccttgttctaccattacgc)，反向引物5’端插入接头Head-R (tcagccacctctttgtcctt)；以待检番茄样品DNA为模板，用带接头的引物组合进行第一轮多重PCR扩增，扩增体系共11个循环后；然后以第一轮的PCR产物为模板，以通用加头序列Head-F/Head-R 为引物，进行第二轮多重PCR 反应；PCR反应体系中以CY3标记的dCTP代替普通dCTP；

方法C、将待检番茄样品DNA先用限制性内切酶AccII(FnuDII)消化，酶切条件为37℃，60min；酶切完成后用Random Primer DNA Labeling Kit Ver.2.0（TaKaRa）进行随机引物标记反应；反应体系中以CY3标记的dCTP代替普通dCTP。