[发明专利]一种TRPC6蛋白的双抗体夹心ELISA检测方法和试剂盒

权利要求书

1.一种TRPC6蛋白的双抗体夹心ELISA检测方法，其特征在于，包括如下步骤：用TRPC6蛋白单克隆抗体mAb-H8包被微孔板，封闭液封闭微孔板后，分别加入标准TRPC6多肽和待测样品的稀释液，再加入TRPC6蛋白多克隆抗体pAb-T和酶标二抗，洗涤后加底物显色，测定OD 值，计算待测样品中TRPC6蛋白浓度；

所述TRPC6蛋白单克隆抗体mAb-H8是由杂交瘤细胞株H8分泌后纯化得到；mAb-H8的工作浓度为5~20μg/mL；

所述TRPC6蛋白多克隆抗体pAb-T是由TRPC6多肽-KLH偶联物免疫小鼠后分离血清纯化得到的；TRPC6多肽的序列如SEQ ID NO：1所示；pAb-T的工作浓度为2.5~10μg/mL；

所述封闭液为5%脱脂奶粉37 ℃封闭1.5~2.0小时；或者，5%牛血清白蛋白37 ℃封闭1.0~1.5小时，或者5%胎牛血清37 ℃封闭1.5~2.0小时。

2.根据权利要求1所述TRPC6蛋白的双抗体夹心ELISA检测方法，其特征在于，所述mAb-H8的工作浓度为10μg/mL；所述pAb-T的工作浓度为5μg/mL。

3.根据权利要求1所述TRPC6蛋白的双抗体夹心ELISA检测方法，其特征在于，所述封闭液为5%脱脂奶粉37 ℃封闭1.5小时。

4.根据权利要求1所述TRPC6蛋白的双抗体夹心ELISA检测方法，其特征在于，所述mAb-H8和pAb-T都是采用优化辛酸-硫酸铵盐析法纯化得到的，优化辛酸-硫酸铵盐析法的优化条件为细胞培养上清与乙酸-乙酸钠缓冲液体积比为1:2~2:1 ，辛酸终浓度为25~35μL/mL，硫酸铵饱和度为35~45%，硫酸铵沉淀时pH值为7.0~7.4。

5.根据权利要求4所述TRPC6蛋白的双抗体夹心ELISA检测方法，其特征在于，所述优化辛酸-硫酸铵盐析法的优化条件为细胞培养上清与乙酸-乙酸钠缓冲液体积比为1:1 ，辛酸终浓度为30μL/mL，硫酸铵饱和度为40%，硫酸铵沉淀时pH值为7.2。

6.根据权利要求1所述TRPC6蛋白的双抗体夹心ELISA检测方法，其特征在于，所述pAb-T是通过以下方法制备得到的：每次取100~120μg TRPC6多肽-KLH偶联物采用小鼠皮下多点注射法，间隔3周，对小鼠进行三次免疫处理，第三次免疫后1周后采血测其效价，选择效价大于1：10000的进行加强免疫，加强免疫3天后取血，分离血清，优化辛酸-硫酸铵盐析法纯化抗体，保存备用；所述TRPC6多肽的序列如SEQ ID NO：1所示。

7.根据权利要求1所述TRPC6蛋白的双抗体夹心ELISA检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

    S1.将工作浓度为10μg/mL的TRPC6蛋白单克隆抗体mAb-H8包被微孔板，100~120 μL/ 孔，4℃包被过夜；PBST 洗涤3 次，350μL/孔，拍干；

    S2.加入5% 脱脂奶粉，100~120 μL/ 孔，37℃包被1.5小时；PBST 洗涤3 次，350μL/孔，拍干； 

S3.分别加入标准TRPC6多肽和待测样品的稀释液，100μL/孔，37℃孵育1小时；PBST 洗涤3 次，350，拍干；

S4.再加入工作浓度为5μg/mL的TRPC6蛋白多克隆抗体pAb-T，37℃孵育1小时；PBST 洗涤3 次，350，拍干；

S5.再加入1:5000 稀释的羊抗鼠HRP-IgG，37℃孵育1小时；PBST 洗涤3 次，350，拍干；

S6.加入OPD 底物溶液，100 μL/ 孔，37℃避光反应15min ；加入2M 硫酸终止反应，100μL/孔；酶标仪490nm处测定OD 值；绘制标准曲线，计算待检样品中TRPC6蛋白含量。

8.一种检测TRPC6蛋白的ELISA 试剂盒，其特征在于，包括酶标板和夹心抗体，所述的酶标板包被TRPC6蛋白单克隆抗体mAb-H8，所述的夹心抗体为TRPC6蛋白多克隆抗体pAb-T；

    所述TRPC6蛋白单克隆抗体mAb-H8是由杂交瘤细胞株H8分泌后纯化得到；所述酶标TRPC6蛋白多克隆抗体pAb-T是由TRPC6多肽-KLH偶联物免疫小鼠后分离血清纯化得到TRPC6蛋白多克隆抗体pAb-T后再进行酶标记；所述TRPC6多肽的序列如SEQ ID NO：1所示。

9.根据权利要求8 所述的ELISA 试剂盒，其特征在于，所述酶标抗体的标记酶为辣根过氧化物酶。