[发明专利]海水发酵型产生物表面活性剂菌株的筛选方法

权利要求书

1.一种海水发酵型产生物表面活性剂菌株的筛选方法，其特征在于，该方法的具体步骤如下：

(1)采样

主要采集以下样品：近海海水；沿海滩涂植物根际土壤；盐场卤水；盐场土样。采集后立刻带回保存于4℃中。

(2)富集培养

取土样和水样接种于盐度逐渐升高的产表活培养基中，即由1％、2％、3％升至3.5％，在30℃、150rmp转速的恒温摇床上振荡培养，每次3-5天时间，培养基明显乳化时按10％的量接种下一盐度的产表活培养基。直到含盐3.5％的培养基培养完成，驯化结束。

(3)高盐血平板分离

取富集后的菌液，稀释至适宜倍数涂布于血平板上，30℃培养1-3天，直到有明显的溶血圈产生。

(4)菌种保存、编号

挑取菌落特征有代表性、产明显溶血圈的菌落30个以上接种于斜面中30℃培养1-2天长出菌苔后，置4℃备用。

(5)海水发酵验证

各菌株用肉胨培养基培养种子后，按5％的接种量接产表活培养基(含3.5％的NaCl)和海水产表活培养基进行摇瓶发酵，在30℃、150rmp转速的恒温摇床上培养3d后测定表面张力和发酵液排油圈大小。测定表面张力采用表面张力仪，排油圈测定大小的方法是：在90mm培养皿小盖中，加入20mL去离子水，滴加100μL柴油，形成油膜后，再在油膜中心用微量取样器加入10μL的发酵液。如果排油圈直径超过培养皿小盖的直径，则将发酵液稀释10倍后再加入。取排油圈较大且表面张力明显降低的菌株3-5株，之后进行生理生化分析和分子鉴定，以获得菌株的属种分类信息，便于下一步的改良和发酵工艺优化。

2.根据权利要求1所述的一种产表面活性剂的烃降解菌的分离筛选方法，其特征是：产表面活性剂培养基成份为：NaNO₃ 2.5g，K₂HPO₄ 4.0g，KH₂PO₄ 4.0g，CaCl₂·2H₂O 0.1g，MgSO₄ 0.2g，KCl 1.0g，酵母粉1.0g，炸货油30mL或可溶性碳源30g，NaCl 10-35g(即浓度为1％-3.5％)，去离子水1000mL，pH值最后调整为6.5，分装摇瓶后加入碳源，121℃灭菌后备用。

3.根据权利要求1所述的一种产表面活性剂的烃降解菌的分离筛选方法，其特征是：

海水产表活培养基的配制方法为：酵母粉1g，炸货油30mL(或可溶性固体碳源30g)，中速滤纸过滤后的天然海水1000mL，自然pH值，分装入150mL摇瓶(装液量30mL)，121℃灭菌后备用。

4.根据权利要求1所述的一种产表面活性剂的烃降解菌的分离筛选方法，其特征是：

血平板采用肉胨培养基中加入5％的脱纤维羊血获得。肉胨培养基成份为(/L)：蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠35g，纯净水或自来水1L，调pH至7.0左右。配制血平板时要加1.5％的琼脂粉，灭菌后取出冷却至50℃左右时，加入5％的脱纤维无菌羊血，迅速分配至培养皿中，冷却后即得血平板。