[发明专利]一种高含腐殖质的河口底泥总DNA提取方法

权利要求书

1.一种从高含腐殖质的河口底泥中提取总DNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)底泥样品的预处理：

①称取10g河口底泥放入50ml离心管中，加入30ml生理盐水，涡旋振荡5min，静置2min，在4℃下先2500r/min低速离心3min，再10000r/min高速离心8min，弃上清，取沉淀的上部1/2转移到另一新的离心管中；

②重复上步2次，将得到1.25g底泥转移到10ml离心管中；

③用生理盐水洗涤底泥，在4℃下10000r/min离心8min，洗涤次数直到离心后的上清为无色透明为止；

(2)底泥微生物的细胞裂解：

①1.25g经过预处理的底泥加2.5mL CTAB溶液，涡旋充分混匀；

②在液氮和65℃水浴中反复冻融3次；

③在37℃下摇30min；

(3)DNA的分离：

①加10％的SDS到终浓度2％，65℃水浴保温2h，每隔15-20min颠倒混匀一次；

②室温12000r/min离心10min，收集上清；

③上清加等体积酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)，轻轻颠倒混匀；室温12000r/min离心10min，留上清；酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)抽提3次；

④上清加等体积的异丙醇，沉淀1-2h；在4℃下，以12000r/min离心10min，弃上清；

⑤用70％的冰冻乙醇洗涤DNA沉淀，在4℃下，以12000r/min离心5min，留沉淀；70％的冰冻乙醇洗涤DNA沉淀3次，自然干燥；

⑥用TE(pH8.0)溶解DNA沉淀，得到河口底泥总DNA粗提液；

(4)DNA的纯化：

①步骤(3)中DNA粗提液加3倍体积的冰冻无水乙醇，在-20℃下沉淀1-2h；在4℃下，以12000r/min离心10min，留沉淀；

②沉淀用70％的冰冻乙醇洗涤2次，在4℃下，以12000r/min离心5min，留沉淀，自然干燥；

③用TE(pH8.0)溶解DNA沉淀，得到最终河口底泥总DNA；DNA跑0.8％的琼脂糖凝胶电泳；

(5)16S rDNA的PCR：以步骤(4)提取的DNA为模板，用细菌16S rDNA通用引物63F(5′-CAGGCCTAACACATGCAAGTC-3′)和1387R(5′-GGGCGGWGTGTACAAGGC-3′)进行PCR，PCR产物跑1％的琼脂糖凝胶电泳。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(1)的生理盐水：0.85％的NaCl溶液，用4M NaOH溶液调节至pH＝9.5，121℃高压灭菌20min。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(2)的CTAB溶液，由终浓度为100mM的Tris-HCl，100mM的EDTA，1.5M的NaCl，1％的CTAB，1mg/ml的溶菌酶和0.2mg/ml的蛋白酶K组成(溶菌酶和蛋白酶K用时再加入)。

4.如权利要求1所述的方法在各种类型的沟河底泥和土壤总DNA提取中的应用。