[发明专利]黄海希瓦氏菌胶体金免疫层析试纸条及制备方法

权利要求书

1.一种黄海希瓦氏菌胶体金免疫层析试纸条，有底板（5），在底板（5）上从一端依次由上至下呈阶梯状地粘有样品垫（4）、金标垫（3）、硝酸纤维素膜（2）及吸水垫（1），其特征在于：所述金标垫（3）上喷涂有胶体金标记的黄海希瓦氏菌单克隆抗体，硝酸纤维素膜（2）上有包被黄海希瓦氏菌多克隆抗体的检测线a及由羊抗鼠IgG构成的质控线b，所述黄海希瓦氏菌单克隆抗体是由保藏号为CGMCC No.7303的抗刺参“化皮病”病原菌-黄海希瓦氏菌单克隆抗体的杂交瘤细胞株SM-3D9免疫小鼠，得小鼠腹水经纯化制备而成。

2. 一种如权利要求1所述的黄海希瓦氏菌胶体金免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于按以下步骤进行：

a. 制备黄海希瓦氏菌单克隆抗体：取保藏号为CGMCC No.7303的抗刺参“化皮病”病原菌-黄海希瓦氏菌单克隆抗体的杂交瘤细胞株SM-3D9免疫小鼠，取小鼠腹水，置离心管离心后收集上清并纯化，即得黄海希瓦氏菌单克隆抗体；

b. 制备胶体金：采用柠檬酸三钠作为还原剂制备18~20nm胶体金溶液，并调整胶体金溶液的pH至8.2，备用；

c. 制备胶体金标记的黄海希瓦氏菌单克隆抗体：在电磁搅拌器下将黄海希瓦氏菌单克隆抗体缓慢加入备用的胶体金溶液中，黄海希瓦氏菌单克隆抗体的质量和胶体金溶液的体积比为0.025：1，经纯化和浓缩后形成胶体金标记的黄海希瓦氏菌单克隆抗体；

d. 对金标垫和硝酸纤维素膜处理：将胶体金标记的黄海希瓦氏菌单克隆抗体以9ul/cm²均匀喷涂在金标垫上；将黄海希瓦氏菌多克隆抗体稀释成1.2mg/ml，以2μl/cm喷涂于硝酸纤维素膜上，形成检测线a；将羊抗鼠IgG稀释成2mg/ml，以2μl/cm喷涂于硝酸纤维素膜上，形成质控线b，37℃干燥4h；

e. 组装：将样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次由上至下呈阶梯状固定于不干胶底板上，样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫各部分之间有重叠部分，切成规格宽度的试纸条。

3.根据权利要求2所述黄海希瓦氏菌胶体金免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于所述a步骤是取保藏号为CGMCC No.7303的抗刺参“化皮病”病原菌-黄海希瓦氏菌单克隆抗体的杂交瘤细胞株SM-3D9制成细胞悬液，1000r/min离心5 min，去上清，用1640细胞培养液重悬细胞，使最终细胞密度为5×10⁶个/ml，得到杂交瘤细胞液；用杂交瘤细胞液免疫小鼠，7~10天后取小鼠腹水，置离心管离心，2000r/min，l0min，离心后收集上清并采用Protein-A亲和层析法纯化收集的腹水，即得黄海希瓦氏菌单克隆抗体。

4.根据权利要求3所述黄海希瓦氏菌胶体金免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于所述保藏号为CGMCC No.7303的抗刺参“化皮病”病原菌-黄海希瓦氏菌单克隆抗体的杂交瘤细胞株SM-3D9是按如下方法制备的：

f. 提取黄海希瓦氏菌；

g. 制备黄海希瓦氏菌液并免疫Balb/C小鼠；

h. 取小鼠脾脏进行细胞融合，产生融合的杂交瘤细胞，用间接酶联免疫技术筛选阳性细胞，通过有限稀释法进行克隆。

5.根据权利要求4所述黄海希瓦氏菌胶体金免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于所述提取黄海希瓦氏菌是按如下方法进行：取患“化皮病”刺参，用2216E培养基从溃疡体壁处分离细菌，25℃下培养24～48h，挑取肉红色圆形菌落进一步纯化，即得到黄海希瓦氏菌；所述培养基的组分及用量比例如下：蛋白胨5g，酵母膏1g，琼脂粉20g，磷酸高铁0.01g，陈海水1000ml。

6.根据权利要求5所述黄海希瓦氏菌胶体金免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于所述h步骤是按照如下方法进行：在无菌条件下将免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞用45% PEG1500融合，融合细胞用HAT选择性培养液重悬，滴入加有饲养细胞的96孔细胞培养板中，每孔0.2ml，置于37℃，CO₂浓度为5%的培养箱中培养，两周后，检测杂交瘤细胞上清液，筛选阳性细胞，通过有限稀释法进行克隆，即获得阳性杂交瘤细胞。