[发明专利]树突状细胞的快速分离方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物医学领域，具体是涉及基于纳米磁珠的树突状细胞分离方法。

背景技术

树突状细胞（dendritic cell, DC）是由美国学者Steinman于1973年发现的，是目前所知的功能最强，唯一能活化初始型T细胞的专职抗原递呈细胞（antigen presenting cell, APC），其数量、成熟状态可决定机体免疫状态，故对其深入的研究具有重要理论和实际意义。DC具有体外可操作性，因此获取一定量有功能的DC是深入研究其生物特性的关键。然而，DC在组织中含量甚微，在血液中仅占外周血白细胞0.16-0.68%，占单核细胞 0.5-1.6%，现有方法还无法对外周血中痕量DC直接检测。因此，实现人体外周血中DC的高效富集，使之达到检测方法灵敏度要求，从而为探讨DC在免疫耐受及抗肿瘤方面的作用奠定基础。

免疫磁分离技术是树突状细胞快速分离富集技术的重要组成部分之一，该技术可高效捕获、浓缩人外周血样品中树突状细胞，提高树突状细胞检测灵敏度。近年来，基于磁性微珠的免疫磁分离法（IMS）将抗体连接到磁珠上，然后将连有抗体的磁珠投入样品液中对目标细胞进行捕获、富集，磁分离。然而，目前该基于微米级免疫磁珠的分离技术存在诸多局限性：1）微米磁珠的比表面积相对较小，降低了磁珠捕获效率；2）由于微米磁珠自身的颗粒性质，其与细胞之间通过多相反应（multiphase reaction）结合，通常需要更长的时间去特异性捕获食品基质中的细胞；3）微米磁珠单分散性较差，在全血基质中容易发生自身聚集或形成沉淀；4）传统的免疫磁分离技术，往往是将抗体直接偶联于免疫磁珠上，此过程常常会导致抗体的活性大大地降低并且导致抗体的空间方向发生改变增大了抗体间的空间位阻效应，从而降低了抗体的捕获效率5）血液粘稠度高并且其中非 DC的血细胞浓度大，微米磁珠容易产生非特异性吸附，难以实现对血液中DC的特异性分离；6）微米磁珠的浓度过高会造成DC的破损（磁场导致细胞表面磁珠互相吸引，使细胞受到挤压甚至破裂），导致分离的失败。7）磁珠偶联抗体时，一般采用疏水吸附或化学偶联方式将具有活性的抗体联接在磁珠表面。抗体与磁珠表面距离太近，磁珠本身性质及其表面残留的疏水或强亲水基团容易引起抗体空间构象发生改变，导致抗体生物活性下降。

发明内容

针对现有技术的缺陷，本发明的目的是提供一种捕获效率高、简便分离时间短，低梯度磁场下（小于30 T/m）复杂的全血基质中DC特异性快速分离的方法。包括如下步骤：

树突状细胞的快速分离方法，包括以下步骤：（1）每称取1.0 mg超支化聚合物，悬浮于4 mL 0.01 mol/L，pH 8.0 PBS磷酸缓冲液中，搅拌滴加25%的戊二醛水溶液545 μL，使戊二醛的终浓度为3%，在摇床150 r/min的转速下室温反应3.5 h；加入18.75 mg鼠抗人树突状细胞单克隆抗体，使其终浓度达到3 mg/mL左右，摇床150 r/min 的转速下室温反应24 h；减压旋干溶剂，去离子水溶解，在PBS和去离子水中透析1 d；透析结束将得到的溶液冷冻干燥得超支化聚合物-抗体复合物；（2）取15.7 mg 长链生物素，悬浮于4 mL 0.01 mol/L，pH 8.0 PBS磷酸缓冲液中，搅拌滴加25%的戊二醛水溶液545 μL，使戊二醛的终浓度为3%，在摇床150 r/min的转速下室温反应3.5 h；加入1.0 mg超支化聚合物-抗体复合物，在摇床150 r/min的转速下室温反应24 h；减压旋干溶剂，去离子水溶解，在PBS和去离子水中透析1 d；透析结束将得到的溶液冷冻干燥得长链生物素-超支化聚合物-抗体复合物；（3）每取1 mL正常人新鲜全血，加入0.2 mg抗体和长链生物素共修饰的超支化聚合物即步骤（2）长链生物素-超支化聚合物-抗体复合物，置于混匀仪上，以30 rpm的转速室温孵育15 min；加入0.1 mg修饰有链霉亲和素的纳米磁珠，置于混匀仪上，以30 rpm的转速室温孵育15 min，常规磁力架分离3 min；（4）磁力分离后，去离子水轻轻清洗后，用PBS缓冲液重悬即得富集有树突状细胞的纳米磁珠-链霉亲和素-长链生物素-超支化聚合物-抗体-DC复合物。

所述超支化聚合物为氨基化的超支化聚酰胺-胺，其分子量为 8000 Da。结构如图1。

所述纳米磁珠粒径为20-50nm，优选为30 nm。

超支化聚合物通过氨基和DC抗体的羧基实现超支化聚合物和抗体的共价偶联。