[发明专利]一个控制水稻叶绿体早期发育基因及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及农业和植物生物技术等领域，特别是在分子水平上进行植物遗传育种以及植物生理、基因功能等基础研究。 

背景技术

叶绿体是高等植物进行光合作用的场所，而叶绿体的发育受一系列核质基因的控制。研究表明控制叶绿体发育的基因被破坏可导致叶绿体发育受阻，进而使植物叶色发生异常，甚至使光合作用效率急剧下降。目前，研究工作者们利用物理、化学、生物等诱变得到水稻叶色突变体，将其应用于水稻的遗传育种、生理及其相关基因的克隆和功能研究。本研究利用经物理诱变得到的水稻早期苗色突变体并通过图位克隆技术定位到一个控制叶绿体发育的基因，至今尚未有与水稻此基因相关的文献报道。 

发明内容

本发明的目的在于提供一个控制早期水稻叶绿体发育的基因、该基因编码的蛋白质及这种基因的检测方法和应用。 

水稻中该控制水稻叶绿体早期发育的基因若被破坏，即可导致早期水稻植株黄化。 

这种控制早期水稻叶绿体发育的基因，具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。优选的，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。 

所述的基因序列所编码的蛋白质，具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。优选的，氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。 

一对用于检测上述基因的特异性引物，序列为： 

上游：5′- TCATTGCTGATGCATTGGAG -3′

下游：5′- CACCCGCTGATCAGTTAAAA -3′

即SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示的序列。

检测这种控制早期水稻叶绿体发育的基因的方法为，采用上述特异性PCR引物对水稻苗期所提取的DNA进行PCR扩增反应，得到404bp核苷酸片段，说明含有控制早期水稻叶绿体发育的基因。优选的，404bp核苷酸片段序列如SEQ ID No.3所示。优选的，将所得到的得到404bp片段用ScaI酶切，出现长度为267bp和137bp的特异性片段，说明含有控制早期水稻叶绿体发育的基因。 

在本发明研究中，发明人设计的特异性的PCR引物和检测方法，能对水稻苗期所提取的DNA进行PCR扩增，其产物用ScaI进行酶切鉴定，根据酶切带型能快速检测到含有此基因的水稻品种，其检测的准确性高，操作简单，成本低廉。若一个水稻品种中含有此基因，则用上述引物能够扩增出长度为404bp的特异性片段。然后用ScaI对该片段进行酶切，其酶切带型为出现两个特异性片段，长度为267bp和137bp。 

水稻黄化突变体材料是由粳稻“嘉花1号”经⁶⁰Coγ射线辐照而来，经海南、上海两地多年自交加代和选择，已成为各种农艺性状稳定的品系。发明人在研究中将此突变品系与籼稻“培矮64S”配制正反交组合，构建遗传群体，利用SSR和InDel分子标记将控制叶绿体发育的基因定位在水稻的第9号染色体。 

本发明控制早期水稻叶绿体发育的基因与其启动子同农杆菌表达载体连接，并通过农杆菌介导的转基因技术将该DNA序列转入黄化突变体后，其后代植株叶色变绿，说明该基因被破坏即可导致早期水稻叶绿体发育受阻，使植株黄化。通过本发明得到的控制早期水稻叶绿体发育的基因可应用于杂交水稻制种，可提高杂交水稻不育系自身以及由它配制杂交水稻的纯度。 

附图说明

图1为本发明的特异性PCR引物对该基因进行PCR扩增结果； 

图2为本发明对PCR扩增产物进行SacI酶切检测结果。图中，M代表Marker；T1代表扩增的PCR产物；T2代表扩增的PCR产物Taq I酶切后的片段。

具体实施方式

实施例1    水稻DNA提取 

1、称取0.5g新鲜的苗期水稻叶片，把叶片剪成0.5cm长的小段，放到预冷的研钵中，加入液氮研磨至粉末状，之后转入1.5ml离心管中，加入1ml 60℃预热的2×CTAB，轻轻震荡后60℃水浴45min，期间震荡2次。

2、 取出离心管，冷却置室温，12000转/分的条件下离心5min，吸取上清液，加入等体积氯仿-异戊醇(24：1)混合液，充分混匀。 

3、 将含有溶液的离心管进行平衡，12000转/分的条件下离心5min，吸取上清液，加入其2/3体积异丙醇，轻轻混匀使核酸析出。 

4、 12000转/分的条件下离心5min，使核酸沉淀，弃上清，用70%乙醇洗涤，室温干燥后溶于10μl的无菌水中。 

5、 取2μl 用于后续的PCR扩增反应。 

实施例2   PCR扩增和基因检测