[发明专利]β-葡萄糖苷酶的突变体Pbgl-W386C及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种β-葡萄糖苷酶突变体及其应用，该突变体酶的特征在于它在酶反应中的葡萄糖的耐受能力是突变前的11.88倍，提高了10.88倍，该突变体蛋白质能够在降解纤维二糖中应用。

背景技术

燃料乙醇具有可再生、排放物无污染、延长汽车零部件寿命等优点（杨俊召。甲醇燃料——21世纪的石油替代燃料。广州化工，2010，05：71-73.）。目前世界上生产燃料乙醇的技术根据原料来源可分为三种：(1)使用小麦、玉米等粮食的淀粉类技术；(2)使用甘蔗、高粱的糖类技术；(3)使用农、林业废弃品的纤维类技术（刘海军，李琳，白殿国等。我国燃料乙醇生产技术现状与发展前景分析。化工科技，2012，05：68-72.）。从2007年起，为了稳定粮食价格，叫停了以玉米为原材料的生产燃料乙醇的项目。鼓励发展以非粮食为原料的生产燃料乙醇的项目。据我国农业部提供的数据，2012年我国秸秆产出量为7亿吨，其中只有一半被用作燃料，其余的均被作为垃圾燃烧。按照美国4亿吨废弃的秸秆能够产出1吨燃料乙醇的水平来说，这些原材料能够生产出1.75亿吨的燃料乙醇（陈晓进。美国利用纤维素乙醇替代石油的计划进展。国际技术经济研究，2007，04：10-13.）。所以发展燃料乙醇，充分利用资源，应该首先考虑发展利用农、林废弃品的纤维类技术。

纤维素作为构建细胞壁的主要材料存在于所有的高等植物的细胞壁中，是一种由葡萄糖通过β-1,4-糖苷键连接而形成的天然大分子聚合物（Gardner.K.H.,Blackwell.The structure of native cellulose.Biopolymers,1974,13(10):1975-2001.）。脱水葡萄糖是纤维素分子的重复单位，每一个邻近的葡萄糖与旁边的葡萄糖相比都会旋转180°。这个旋转的结果使纤维素分子是高度对称的，使链的两边的羟基数目都是相等的（Zhang Yi-Heng Percival，Lynd Lee R.，Toward an aggregated understanding of enzymatic hydrolysis of cellulose:Noncomplexed cellulase systems.Biotechnology and Bioengineering，2004，88(7):797-824.）。相邻的纤维素分子通过氢键以及范德华力的耦合作用能够形成多种结构。纤维素在结构上可分为三层：(1)单分子层，纤维素单分子即脱水葡萄糖的高分子聚合物；(2)多分子层，即自组装的结晶的纤维素晶体；(3)原纤结构层，纤维素晶体和无定形纤维素分子组成的更大的纤维结构（叶代勇，黄洪，傅和青等。纤维素化学研究进展。化工学报，2006，08：1782-1791.）。一般从植物细胞壁中提取的纤维素会混杂有木质素与半纤维素，这些杂质使纤维素难以降解。现在世界上有三种分解纤维素的方法：(1)化学法。一般使用方法为酸解法、碱处理法和离子液处理法（李建华，张越，刘仲齐。化学处理方法对木质纤维素降解效率的影响评述。生物技术进展，2011，06：421-425.）。但是这些方法成本比较高，处理过程复杂而且含有较多对下一步发酵有影响的物质。(2)物理法。目前较常用的为热裂解法与蒸汽爆破法。这些方法能源消耗高，对设备要求严格限制了其推广以及应用。(3)酶解法。酶解法具有反应条件温和、不污染环境，能源消耗少，反应产物单一等优点，符合环保经济的特征，值得作为分解纤维素生产燃料乙醇的推广方法。

据目前的研究，分解纤维素需要纤维素酶系的三种酶共同作用才能最终降解成葡萄糖（Murray Patrick,Aro Nina,Collins Catherine,et al.Expression in Trichoderma reesei and characterisation of a thermostable family3β-glucosidase from the moderately thermophilic fungus Talaromyces emersonii.Protein Expression and Purification,2004,38(2):248-257.）。

①外切-1,4-β-D-葡聚糖酶(exo-1,4-β-D glucanase或1,4-β-D-glucan cellobiohydrolase，EC3.2.1.91，简称CBH)能够水解纤维素两端(还原端和非还原端)，每次切下一个纤维二糖，使紧密结合的纤维素晶体逐渐分解为单一的纤维素分子。