[发明专利]一种体外扩增胰岛β细胞的方法

说明书

技术领域

本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种体外扩增胰岛β细胞的方法。

背景技术

糖尿病是一种多病因的代谢性疾病，近年来其患病率急剧上升，已继肿瘤、心血管疾病之后成为威胁人类健康的第三大杀手。

糖尿病的治疗手段目前仍是终生治疗，Ⅰ型和部分II型糖尿病患者靠每天定时注射胰岛素来维持血糖稳定，长期的注射给患者带来了极大的病痛和麻烦。现在出现的胰岛移植和细胞治疗的方法，为糖尿病的治疗带来了希望。但是人类胰岛组织来源有限的问题抑制了这些治疗手段的发展和推广应用。例如美国每年约新增Ⅰ型糖尿病患者2万例，而能获得的胰腺供体只有3000个左右，在其他国家则更为缺乏。因此，体外获得大量的胰岛β细胞或促使自身胰岛β细胞增殖更新，发挥功能，成为了糖尿病治疗的研究热点。

目前体外培养胰岛β细胞的方法主要源于干细胞诱导分化，干细胞来源分为胚胎干细胞与成体干细胞。胚胎干细胞可以在体外诱导分化成胰岛β细胞，但胚胎干细胞存在各种伦理学与安全性问题，而成体干细胞虽然分化能力有限，但其来源成人组织器官，非常有希望成为体外诱导分化成胰岛β细胞的前体细胞。干细胞诱导分化胰岛β细胞也存在细胞数量少，增殖慢的缺点，因此，寻找能够在体内或体外促胰岛β细胞增殖的药物，对于治疗糖尿病具有非常重要的意义。

新生成的胰岛β细胞来自于成人的胰腺，因此，胰腺被认为存在有不同类型的干细胞或前体细胞，可分化形成为胰岛β细胞。胰腺干细胞被认为存在于胰腺导管上皮细胞内，人类的胰腺导管组织可在体外诱导分化为分泌胰岛素的胰岛组织，且从胰腺导管上皮细胞中可体外诱导分化形成分泌胰岛素的胰岛β细胞。因此，分离纯化胰腺导管上皮细胞，可作为诱导分化形成胰岛β细胞的前体细胞来源。

Reg基因家族蛋白，即再生基因与再生相关基因，是一组C型凝集素蛋白超家族，在感染、损伤、糖尿病及肿瘤中发生作用。Reg Ⅰα基因最先被Terazono等从切去90%后再生的大鼠胰岛内发现，他们从大鼠再生胰岛cDNA文库分离出编码165个氨基酸的新基因，有21个信号肽，随后又发现了人的Reg Ⅰα基因，编码166个氨基酸，与大鼠Reg Ⅰα有68%同源性。NOD小鼠模型与体外细胞试验同时证明，Reg Ⅰα蛋白具有促胰岛细胞增殖功能。随后的研究发现，切去90%后再生的大鼠胰岛细胞内ADP-ribose多聚酶与Reg Ⅰα启动子区域某一特定反应原件结合，从而激活了Reg Ⅰα的表达。Reg Ⅰα蛋白能够诱导胰腺导管和β细胞分裂增生，因此被认为与胰岛β细胞再生、修复相关。Reg Ⅰα基因可与β细胞细胞膜上的Reg Ⅰα受体相结合，开启β细胞周期加速的信号通路，从而促进β细胞增殖。不含信号肽序列的重组大鼠Reg Ⅰα蛋白，能刺激胰腺切除术后的大鼠β细胞增殖，改善糖尿病。重组人Reg Ⅰα蛋白能刺激NOD小鼠β细胞团扩展，缓解小鼠糖尿病。

由于糖尿病的治疗手段目前仍是终生治疗，胰岛移植和细胞治疗的方法受人类胰岛组织来源有限的问题抑制。因此，体外获得大量的胰岛β细胞或促自身胰岛β细胞增殖更新，成为了糖尿病治疗的研究热点。寻找能够在体内或体外促胰岛β细胞增殖的药物，对于治疗糖尿病具有非常重要的意义。

发明内容

本发明提供了一种体外扩增胰岛β细胞的方法，通过体外扩增胰岛β细胞的方法建立Reg Ⅰα基因促胰岛β细胞增殖模型，并通过该增值模型来筛选促胰岛β细胞增殖的有效药物。

一种体外扩增胰岛β细胞的方法，包括：

（1）制备Reg Ⅰα蛋白的表达上清；

（2）分离纯化胰腺导管上皮细胞，诱导分化获得胰岛β细胞；

（3）将步骤（1）制备的Reg Ⅰα蛋白的表达上清加入到细胞培养基中，接种所述的胰岛β细胞进行培养。

编码Reg Ⅰα蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述Reg Ⅰα蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

所述步骤（1）中，RegⅠα蛋白的表达上清的制备方法为：克隆Reg Ⅰα基因，将Reg Ⅰα基因连入真核表达载体，并转染宿主细胞；转染细胞经完全培养基培养后离心，上清液即为所述的Reg Ⅰα蛋白的表达上清。

所述真核表达载体为PC-DNA3.1（-）。

所述完全培养基为RPMI-1640培养基。所述培养条件为：宿主细胞的接种密度为每孔1×10⁵个细胞，培养温度37℃，培养时间为24-48h。

所述宿主细胞为HEK-293细胞。