[发明专利]肠道病毒71型的GFP示踪系统及其应用

权利要求书

1.重组肠道病毒71型，是将野生型肠道病毒71型基因组RNA进行替换或插入得到的重组病毒；

所述替换为：将所述野生型肠道病毒71型基因组RNA中的片段a中的任一片段换为片段b；

所述插入为：在所述野生型肠道病毒71型基因组RNA中的所述片段a中的任一位点处插入所述片段b；

所述片段a为序列表中序列1编码的RNA；所述片段b为含有绿色荧光蛋白编码基因的DNA片段编码的RNA。

2.根据权利要求1所述的重组肠道病毒71型，其特征在于：所述绿色荧光蛋白的氨基酸序列如序列表中序列2所示。

3.根据权利要求2所述的重组肠道病毒71型，其特征在于：所述绿色荧光蛋白的编码基因为序列表中序列3的第142-861位。

4.根据权利要求1-3中任一所述的重组肠道病毒71型，其特征在于：所述含有绿色荧光蛋白编码基因的DNA片段的核苷酸序列为序列表中序列3。

5.根据权利要求1-4中任一所述的重组肠道病毒71型，其特征在于：所述野生型肠道病毒71型为肠道病毒71型安徽分离株1；或

所述插入中，所述片段a中的任一位点为所述片段a中的序列1的第450位和第451位核苷酸之间。

6.根据权利要求5所述的重组肠道病毒71型，其特征在于：所述重组肠道病毒71型的基因组RNA反转录的cDNA序列为在GenBank号为GQ994988.1的序列的第3346位和第3347位核苷酸之间插入序列表中序列3所示DNA片段后得到的核苷酸序列。

7.制备权利要求1-6中任一所述重组肠道病毒71型的方法，包括如下步骤：

（a）将权利要求1-5任一中所述的野生型肠道病毒71型基因组RNA通过反转录得到的cDNA序列中位于待取代核苷酸序列或待插入位点上游和下游的序列分别克隆至质粒pSV2-gpt的gpt基因的上游和下游，得到重组质粒甲；

所述待取代核苷酸序列或待插入位点位于序列1中；

（b）用含权利要求1-5任一中所述野生型肠道病毒71型基因组RNA通过反转录得到的cDNA序列的痘苗病毒载体甲感染CV-1细胞后，用步骤（a）获得的重组质粒甲转染所述CV-1细胞，所述痘苗病毒载体甲与所述重组质粒甲通过所述位于待取代核苷酸序列或待插入位点上游和下游的序列发生同源重组，获得以所述gpt基因替代所述痘苗病毒载体甲中的所述待取代核苷酸序列，或在所述痘苗病毒载体甲中的所述待插入位点处插入所述gpt基因的重组痘苗病毒载体乙；

（c）将步骤（a）中的所述重组质粒甲中的所述gpt基因替换为权利要求1-4任一中所述的含有绿色荧光蛋白的编码基因的DNA片段，得到重组质粒乙；

（d）用步骤（b）得到的重组痘苗病毒载体乙感染新的CV-1细胞后，用步骤（c）获得的重组质粒乙转染所述新的CV-1细胞，所述重组痘苗病毒载体乙与所述重组质粒乙通过所述位于待取代核苷酸序列或待插入位点上游和下游的序列发生同源重组，获得以所述含有绿色荧光蛋白的编码基因的DNA片段替代所述重组痘苗病毒载体乙中所述gpt基因的重组痘苗病毒载体丙；

（e）提取步骤（d）得到的重组痘苗病毒载体丙的基因组DNA，通过体外转录，获得所述重组痘苗病毒载体丙的基因组的全长RNA；将所述全长RNA转染BHK-21细胞，培养转染后的细胞，获得所述重组肠道病毒71型。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述方法的步骤（a）中，位于待取代核苷酸序列或待插入位点上游和下游的序列分别为GenBank号为GQ994988.1的序列的第2897-3346位和第3347-3797位的序列。

9.权利要求1-6中任一所述重组肠道病毒71型在如下（a1）或（a2）中的应用：

（a1）制备研究肠道病毒71型感染机制的产品；

（a2）制备筛选抗肠道病毒71型药物的细胞模型。

10.如下（b1）或（b2）的生物材料：

（b1）含有权利要求1-6中任一所述重组肠道病毒71型的离体动物细胞或重组菌；

（b2）含有权利要求1-6中任一所述重组肠道病毒71型的基因组RNA或cDNA的载体。